Таблиця 2 – Причини підвищення активності ГГТП у сироватці крові
| Тип змін | Причини |
| Перевищення верхньої межі норми >10 разів | алкогольне ураження печінки; холестаз; рак підшлункової залози з обструкцією жовчної протоки |
| Перевищення верхньої межі норми в 5–10 разів | гепатит (гострий і хронічний); цироз (без холестазу); інші захворювання печінки; панкреатит |
| Перевищення верхньої межі норми <5 разів | алкоголізм; ятрогенні отруєння (антиконвульсанти, фенобарбітал, фенітоїн); застійна серцева недостатність |
Аналіз зведених даних про активність «печінкових» ферментів у сироватці крові при деяких захворюваннях і станах (табл. А.2) показує, що активність ГГТП є високочутливим індикатором захворювань печінки, жовчовивідних шляхів і підшлункової залози. Особливо ефективне застосування такого маркера в діагностиці в комплексі з іншими ферментами печінкового профілю.
Визначення активності ГГТП базується на вимірюванні швидкості ферментативної реакції перенесення гамма-глутамілової групи з субстрату-донора на субстрат-акцептор. У першому методі визначення активності ферменту був використаний його природний субстрат глутатіон. Проте цей метод складний у виконанні, тому в клінічній біохімії значного поширення не набув. Сучасні лабораторні способи визначення активності ГГТП базуються на застосуванні синтетичних хромогенних субстратів-донорів. Починаючи з 60-х років ХХ ст. як такий субстрат більшість біохімічних лабораторій використовували гамма-глутаміл-р-нітроанілід, а як субстрат-акцептор гамма-глутамілової групи – гліцилгліцин. Цей колориметричний тест базується на такій ферментативній реакції:
L-гамма-глутаміл-р-нітроанілід + гліцилгліцин ---> L-гамма-глутамілгліцилгліцин + р-нітроанілін.
Активність ГГТП визначається за швидкістю розщеплювання хромогенного субстрату з утворенням р-нітроаніліну, інтенсивність забарвлення якого (оптична густина при довжині хвилі 405 нм) пропорційна активності ферменту в аналізованій пробі. Широке застосування такого методу на практиці та в наукових дослідженнях дозволило встановити нормальні значення активності ГГТП у сироватці крові пацієнтів різного віку й статі, а також величин, що відповідають різним патологічним станам, на які орієнтуються і сьогодні.
До недоліків застосування гамма-глутаміл-р-нітроаніліду як хромогенного субстрату належить його низька розчинність, що утруднює приготування його розчину з необхідною концентрацією, а також недостатня стабільність робочого розчину, в якому при зберіганні спонтанно утворюється р-нітроанілін. Цих недоліків позбавлений широковживаний на сьогодні для аналізу ГГТП гамма-глутаміл-3-карбокси-4-нітроанілід (ГГКНА). Цей субстрат із розчинністю, в 50 разів вищою, ніж гамма-глутаміл-р-нітроанілід, утворює високостабільні розчини. Кінетичні константи ферментативної реакції для обох субстратів подібні.
Міжнародна федерація клінічної хімії (IFCC) рекомендує як референтний метод визначення активності ГГТП колориметричний кінетичний метод із ГГКНА в концентрації, що забезпечує максимальну швидкість ферментативної реакції (6 мМ). Проте для рутинного аналізу в лабораторіях частіше застосовують модифікований метод Зейца (Szasz), в якому концентрація з ГГКНА нижча (3–4 мМ). Результати визначення активності ГГТП, що отримують при цьому, нижчі (приблизно на 7 %), ніж за методом IFCC, проте вони повністю збігаються зі значеннями активності ферменту, що визначають із застосуванням як субстрату гамма-глутаміл-р-нітроанілід.
4.6. Глутаматдегідрогеназа
Глутаматдегідрогеназа (ГлДГ; КФ 1.4.1.3) – фермент, що каталізує перетворення глутамату в α-кетоглутарат і аміак. ГлДГ у незначних кількостях виявлений у нервовій тканині, скелетних м’язах, міокарді й молочній залозі, в найбільшій кількості міститься в клітинах печінки.
Із використанням агар-гелевого електрофорезу виявлено 6 окремих ізоферментів ГлДГ. У сироватці крові практично здорових людей виявляється досить невисока активність ГлДГ, але при захворюваннях печінки вона значно підвищується.
Фермент знаходиться усередині мітохондрій гепатоцитів, тому збільшення його активності відображає глибину цитолізу клітин; за ступенем підвищення активності ГлДГ можна судити про тяжкість патологічного процесу.
Збільшення активності ферменту відбувається при ураженні печінки різної етіології та ураженні жовчовивідних шляхів: гострі гепатити з некрозом печінки, рак печінки, печінкова кома, гостра інтоксикація, механічна жовтяниця і т. п. При вірусному гепатиті ГлДГ підвищується в перший тиждень жовтяничного періоду (це не ранній тест). Висока активність ГлДГ відмічається у хворих на первинний і метастатичний рак печінки. При вираженому загостренні цирозу печінки підйом активності ГлДГ буває значним, причому висока активність ферменту розглядається як несприятлива ознака. Алкогольна інтоксикація супроводжується значним збільшенням активності ГлДГ у крові.
Підвищення активності ГлДГ і ГГТП багато в чому подібне, але є відмінності: висока активність ГлДГ спостерігається при гострих ураженнях печінки, а висока ГГТП – при тривалих патологічних процесах у печінці.
Порівняно зі збільшенням активності ц-АлАТ і м-АсАТ ступінь підвищення активності ГлДГ при некрозі печінкових клітин незначний. Тому, незважаючи на те що ГлДГ є печінково-специфічним ферментом, вираженість змін його активності при ураженні печінкових клітин невелика. Проте паралельне дослідження активності ГлДГ і трансаміназ має значення для оцінки вираженості ступеня цитолізу (некрозу) клітин і диференціальної діагностики жовтяниць. При запальних захворюваннях печінки і некрозі клітин печінки активність ГлДГ вища, ніж трансаміназ. Унаслідок цього коефіцієнт (АсАТ+АлАТ)/ГлДГ зменшується. Низькі показники цього коефіцієнта виявляються також при обтураційній жовтяниці, метастазах раку в печінку.
У перші тижні жовтяниці при гострому гепатиті активність ГлДГ постійно підвищується, більш значно – при некротизуючих формах ураження печінки. Активність трансаміназ при таких дифузних ушкодженнях печінки зростає в 20–25 разів, унаслідок цього числове значення коефіцієнта (АсАТ+АлАТ)/ГлДГ різко збільшується.
При механічній жовтяниці активність ГлДГ підвищується частіше і більш значно, ніж при гострому гепатиті.
Одночасне дослідження активності ГлДГ і сорбітолдегідрогенази (СДГ) дозволяє розрахувати коефіцієнт СДГ/ГлДГ. У перший тиждень вірусного гепатиту цей коефіцієнт, як правило, перевищує 0,5, становлячи у середньому 1,3. У перший тиждень обтураційної жовтяниці він нижчий за 0,5. Цінність цього коефіцієнта – у можливості його використання у першу добу жовтяничного періоду.
Таким чином, підвищення активності ГлДГ спостерігається найчастіше при активному хронічному гепатиті, обтураційній (механічній) жовтяниці (на фоні підвищеної активності ГГТП, ЛФ), ракові печінки, гострій інтоксикації, наприклад, при отруєннях грибами (при цьому значення активності ферменту сягають 1000 Од/л при нормі менше 3,2 Од/л), гострому порушенні кровообігу в печінці при тромбозі печінкової вени, закупоренні печінкової артерії, гострій правосерцевій недостатності (що супроводжується підвищенням активності ферменту до 1000 Од/л і вище).
Активність ГлДГ визначають за допомогою оптичного тесту Варбурга. При 4 °С фермент не втрачає активності впродовж 48 годин. В еритроцитах ГлДГ відсутня.
4.7. Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа
Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа (Г6ФДГ; КФ 1.1.1.49) – фермент, що бере участь у процесах окиснення глюкози, каталізуючи НАДФ-залежне окиснення глюкозо-6-фосфату до 6-фосфоглюконату.
Найбільший вміст ферменту виявлений у селезінці, лімфатичних вузлах, еритроцитах і молочній залозі. Одним із основних постачальників НАДФН для глутатіонової антиоксидантної системи є пентозофосфатний шлях, ключовим ферментом якого є Г6ФДГ. У великій кількості міститься в еритроцитах і використовується в основному для виявлення спадкових захворювань, пов’язаних із дефіцитом ферменту – найбільш поширеної спадкової гемолітичної анемії, зумовленої дефіцитом активності Г6ФДГ еритроцитів. Ця спадкова патологія поширена в країнах Середземномор’я, Індії, Африки, Середньої Азії. При масових обстеженнях використовують якісний уніфікований метод – пробу Бернштейна (проба на дефіцит Г6ФДГ), що в нормі дає негативну реакцію. Гетерозигот із будь-якими варіантами дефіциту Г6ФДГ часто важко виявити і на цей момент для діагностики варіантів Г6ФДГ проводять аналіз ДНК.
У результаті порушень у будові молекули ферменту еритроцити стають неміцними й руйнуються в кровоносному руслі. Залежно від характеру і локалізації мутації в молекулі ферменту (відомо більше 200 мутантних форм Г6ФДГ) клінічні варіанти ензимопатії різні і можуть не виявлятися взагалі, виявлятися епізодичним гемолізом під впливом деяких харчових продуктів (бобові) або лікарських препаратів (протималярійні засоби хінолінового ряду, сульфаніламіди, нітрофурани, жарознижувальні засоби, протитуберкульозні препарати та ін.), вірусів гепатиту і грипу, а також супроводжуватися хронічним гемолізом, викликаючи незалежно від зовнішніх чинників хронічну несфероцитарну гемолітичну анемію (спостерігається рідко).
Еритроцитарна активність Г6ФДГ збільшується при тиреотоксикозі, введенні тиреоїдних гормонів. Підвищення активності Г6ФДГ у сироватці крові відмічається після інфаркту міокарда (пік активності спостерігається на більш пізніх термінах, ніж для АсАТ і ЛДГ) та інфаркту легені.
4.8. Еластаза
Еластаза-1 (панкреатична) (КФ 3.4.21.11) є протеолітичним ферментом, синтезується в ацинарних клітинах підшлункової залози й екскретується в просвіт дванадцятипалої кишки разом з іншими ферментами, у вигляді попередника – проеластази, що активується трипсином. Еластаза абсолютно специфічна для підшлункової залози і не детектується ні в яких інших органах або тканинах.
У сироватці крові людини містяться високоактивні інгібітори еластази: альфа-1-антитрипсин і альфа-2-макроглобулін. Інгібітори регулюють рівень активності еластази відповідно до фізіологічних потреб.
У крові здорових людей активність панкреатичної еластази-1 майже не визначається або дуже низька (норма 0,1–4,0 нг/мл).
Сироваткова еластаза внаслідок запальних процесів підшлункової залози потрапляє в загальний кровотік через ушкоджені клітинні мембрани. Подібно до інших панкреатичних ферментів (амілаза, ліпаза) показник панкреатичної еластази починає збільшуватися в крові в гострий період панкреатиту, що дозволяє поставити діагноз цього захворювання. Концентрація ферменту починає зростати вже через 6 годин від початку захворювання, а через 48 годин досягає максимальних показників, що свідчить про розвиток гострого панкреатиту. Еластаза панкреатична має триваліший період напіврозпаду, ніж амілаза й ліпаза, тому її концентрація залишається підвищеною впродовж декількох днів (в основному 3–5 днів, в окремих випадках до 10 днів). Цей тест призначається в комплексі з іншими тестами для диференціальної діагностики або підтвердження діагнозу «гострий панкреатит».
Еластаза (у калі). Людська панкреатична еластаза-1 не руйнується при проходженні по кишечнику. Визначення панкреатичної еластази-1 в калі – новий неінвазивний тест для оцінки екзокринної функції підшлункової залози. Скринінг ендокринної панкреатичної недостатності здійснюють, коли підозрюють наявність хронічного панкреатиту або кістозного фіброзу, а також при тривалому моніторингу вже виявленої недостатності підшлункової залози при хронічному панкреатиті. Орієнтуючись на рівень еластази-1 в калі, можна точніше призначати ферментні препарати та робити прогноз захворювання.
Для визначення ферменту кал збирають упродовж 72 год і аналізують того ж дня: за необхідності він може бути заморожений при –20 °С. На результати визначення панкреатичної еластази-1 в калі не впливає проведення замісної терапії препаратами ферментів підшлункової залози. Рівень еластази-1 у калі визначається імуноферментним методом із використанням моноклональних антитіл і в нормі становить не менше 200 мкг/г калу. Нижчі показники свідчать про наявність екзокринної панкреатичної недостатності. Специфічність тесту при дослідженні калу становить 94 %, чутливість – 93 %. Визначення еластази-1 у калі використовують в усіх випадках, коли є підозра на екзокринну недостатність підшлункової залози й обговорюється питання про застосування препаратів панкреатичних ферментів, оскільки використання цього методу дозволяє уникнути їх необґрунтованого призначення. Зниження активності панкреатичної еластази-1 у калі виявляють у хворих на хронічний панкреатит (важливо зазначити, що показники фекальної еластази реально взаємозв’язані з тяжкістю перебігу та швидкістю прогресування хронічного панкреатиту), рак підшлункової залози, цукровий діабет І типу (менше 100 мкг/г у 3 % хворих) і ІІ типу (менше 100 мкг/г у 12 % хворих), у дітей із муковісцидозом, що відображає недостатність екзокринної функції підшлункової залози у таких групах пацієнтів.
4.9. Креатинкіназа
Креатинкіназа, або креатинфосфокіназа (АТФ: креатин-фосфотрансфераза, КК; КФ 2.7.3.2), каталізує оборотну реакцію фосфорилювання креатину за участю АТФ, унаслідок чого утворюються креатинфосфат і AДФ.
Молекула ферменту містить дві активні тіолові групи, що відіграють важливу роль у здійсненні його каталітичної функції. У зв’язку з цим деякі тіолові сполуки (глутатіон, цистеїн) справляють на КК активуючу дію. Активність ферменту підвищується під впливом тироксину, іонів магнію, марганцю, кальцію та знижується під дією іонів цинку, міді, ртуті.
КК є димером, що складається з двох субодиниць, кожна з молекулярною масою приблизно 40 кДа. Субодиниці В (від brain – мозкова) і М (від muscle – м’язова) закодовані в різних генах. Фермент існує у вигляді трьох ізоферментів: КК-ВВ (КК-1) – мозковий, КК–МВ (КК-2) – серцевий і КК-ММ (КК-3) – м’язовий. У електричному полі найбільшу рухливість має КК-ВВ, найменшу — КК-ММ, гібридна форма КК-МВ займає проміжне положення.
КК-ВВ наявний у значних кількостях у мозку, простаті, шлунку, легенях, сечовому міхурі, уретрі, плаценті, щитовидній залозі. КК-МВ в основному знаходиться в серцевому м’язі (25–46 % від загальної активності КК кардіоміоциту) і в невеликій кількості в скелетних м’язах (менше 5 % загальної активності). КК-ММ наявний в основному в клітинах скелетних і серцевого м’язів. Активність КК-ММ у сироватці крові становить 94–96 % від загальної активності КК, КК-МВ – 4–6 %, КК-ВВ – активність слідова або не визначається. Усі три ізоферменти знайдені в цитозолі клітин або зв’язані з міофібрилами. Виявлена й четверта мітохондріальна форма креатинкінази (КК-Mt), яка відрізняється від інших форм імунологічно, а також за електрофоретичною рухливістю. Вона локалізована між внутрішньою й зовнішньою мітохондріальними мембранами, в серці становить до 15 % загальної КК активності.
Активна КК може міститися в сироватці крові у вигляді двох макромолекулярних комплексів: макро-КК тип1 і тип 2. Тип 1 – це КК-ВВ, зв’язана з IgG, або КК-ММ, зв’язана з IgA; тип 2 – це олігомери КК-Mt. Нормальна активність КК (загальна) може варіювати залежно від методу: 10–195 МО/л.
Загальна КК підвищується при багатьох захворюваннях та станах: травми, операції, інфаркт міокарда, зменшення кровопостачання м’язів, міопатії, дерматоміозит, м’язова дистрофія, міокардит, отруєння, що супроводжуються комою, гіпотиреоз, інфекційні хвороби (наприклад, черевний тиф), дегідратація, ураження електричним струмом та ін.
Ширшого застосування визначення активності КК отримало для діагностики інфаркту міокарда. Оскільки у хворих на гостру коронарну недостатність скелетна мускулатура і ЦНС, як правило, не залучені до патологічного процесу, підвищення активності КК у цих випадках, як правило, свідчить про ураження міокарда. При неускладненій стенокардії активність КК залишається нормальною. При дрібновогнищевому інфаркті міокарда чутливість тесту становить 92 %.
При інфаркті міокарда реєстроване підвищення активності КК спостерігається вже впродовж 3–6 год після ангіозного нападу. Проте визначення активності раніше 8 год дає позитивні результати в 31 % випадків. Активність КК є достовірним тестом інфаркту міокарда, починаючи з 8–10 год після початку больового нападу. Максимальний рівень активності досягається впродовж 24 год, і навіть при обширному інфаркті активність КК може повернутися до норми упродовж подальших 48 год. Відносне підвищення активності КК при інфаркті міокарда вище, ніж інших ферментів. Найбільш інформативне дослідження активності КК у динаміці – кожні 4–6 год упродовж доби. Хоча активність КК при інфаркті міокарда є дуже чутливим тестом, проте на нього не можна покладатися при одноразовому визначенні та відсутності інших показників, оскільки підвищення може бути викликане і рядом інших причин, зазначених вище, а також вживанням алкоголю, інтенсивним фізичним навантаженням, станом щитовидної залози, отруєнням снодійними засобами, введенням деяких лікарських препаратів (клофібрат, карбеноксолон). До речі, при інфаркті легені активність КК не перевищує норми, що має диференціально-діагностичне значення. Іноді невелике збільшення активності КК відмічається при застійній серцевій діяльності, тахікардії, емболії легеневої артерії. У 50–80 % випадків дистрофії Дюшена, яка має асимптоматичний перебіг, активність КК сироватки крові підвищена в 3–6 разів, при цьому рівень ферменту може нормалізуватись у період м’язового спокою.
Активність КК у сироватці, як правило, має зворотну залежність із тиреоїдною функцією щитовидної залози. Близько 60 % хворих на гіпотиреоз мають рівень КК, вищий за норму, з перевищенням верхньої межі в середньому в 5 разів. Основний ізофермент при цьому КК-ММ, хоча у 13 % хворих підвищена і КК-МВ, що свідчить про залучення до патологічного процесу не лише скелетних, але й серцевого м’яза. У той самий час у хворих на гіпертиреоз є тенденція до низьких значень активності КК у сироватці крові.
Різке підвищення активності КК (більш ніж у 10 разів) виникає на 1–2-й день порушення мозкового кровообігу, досягаючи максимуму на 3-й день.
Активність фермента значно підвищується у хворих із гострим перебігом ревматизму (ревмокардиту). При ревматоїдному артриті відмічено 5–6-кратне збільшення активності КК у сироватці крові, яке не залежить від ступеня активності запального процесу в цілому. Відмічено залежність ступеня підвищення активності КК від тривалості патологічного процесу, причому максимальні значення отримані у хворих з тривалістю захворювання від 5 до 10 років. У пацієнтів, що хворіють більше 10 років, виявлено деяке зниження активності КК, що, очевидно, пов’язано з переважанням атрофічних змін у скелетних м’язах. Найвища активність фермента відмічалася при ураженні великої кількості суглобів та патологічних змінах у скелетних м’язах.
Активність фермента підвищується при алкогольній інтоксикації (вживання алкоголю може викликати “гострий м’язовий синдром”).
До збільшення активності КК призводить гемоліз, що зумовлено виділенням у сироватку крові аденілатциклази.
Підвищені значення активності КК виявляються і в практично здорових людей після енергійних фізичних вправ, при важкій фізичній праці, спортивних навантаженнях.
Значне зменшення активності КК спостерігається при дії на пробу сироватки крові прямих сонячних або ультрафіолетових променів.
КК-ММ збільшується в сироватці при тих самих станах, що й загальна КК.
КК-МВ значно збільшується при інфаркті міокарда, визначення ізоферменту має діагностичне значення, якщо загальна активність ферменту в сироватці крові підвищується більш ніж у 1,5 раза порівняно з верхньою межею норми. Максимальна активність КК-МВ спостерігається через 20 год після прояву перших клінічних симптомів інфаркту міокарда, зниження до нормального рівня, як правило, відбувається через 40–50 год від початку захворювання. Підвищення активності КК-МВ у сироватці крові корелює з наявністю вогнища ураження міокарда, а при тривалому динамічному спостереженні – і з розміром зони некрозу. Вірогідність встановлення діагнозу інфаркту міокарда підвищується, якщо крім збільшення активності окремих ферментів крові враховувати зміну їх співвідношення. Так, у гострому періоді інфаркту міокарда співвідношення КК-МВ/загальна КК збільшується від 3 до 40 %. Крім інфаркту міокарда КК-МВ може незначно збільшуватися при міокардиті, стенокардії, затяжній аритмії, тяжких отруєннях.
Необхідно зазначити, що на цей час як специфічні маркери загибелі кардіоміоцитів використовують міокардіальні ізоформи тропоніну Т (Тн Т) і тропоніну І (Тн І). Визначення вмісту Тн Т дозволяє провести діагностику інфаркту міокарда як на ранніх, так і на пізніх термінах. Вміст Тн Т у крові підвищується вже через декілька годин після нападу стенокардії. Рівень Тн Т виявляється високим у ті терміни неускладненого інфаркту міокарда, коли рівень міоглобіну й активність КК-МВ вже стали у нормі. Тому особливо важливим є дослідження Тн Т у хворих, які госпіталізовані у стаціонар через 2–3 дні після нападу стенокардії, коли показники КК і КК-МВ можуть вже нормалізуватися. Крім того, порівняно з КК і КК-МВ вміст тропонінів у крові підвищується більшою мірою, що характеризує їх вищу діагностичну чутливість. Порівняльне дослідження Тн Т і Тн І виявило більш високу діагностичну чутливість Тн І. Так, рівень у крові Тн І при інфаркті міокарда може майже у 100 разів перевищувати верхню межу норми. Визначення Тн І можна використовувати з метою діагностики інфаркту міокарда у пацієнтів із супутнім пошкодженням скелетних м’язів. Так, виявлено, що гострі та хронічні пошкодження скелетних м’язів, надмірне фізичне навантаження, хірургічні операції (крім операцій на серці), м’язові травми не викликають підвищення рівня Тн І. Визначенню обох форм Тн Т і Тн І надається перевага при діагностиці інфаркту міокарда, що розвивається у післяопераційному періоді та після активних реанімаційних заходів.
Вважають, що активність КК-ВВ може бути тестом аноксії тканин. Активність КК-ВВ у крові може бути також наслідком гіпоксичного ушкодження мозку, особливо в умовах перинатальної гіпоксії. Активність КК-ВВ збільшена у 53 % новонароджених із асфіксією. КК-ВВ наявний у гладкій мускулатурі, але не визначається в сироватці крові у осіб із доброякісними захворюваннями цих тканин. Одним із можливих пояснень підвищення активності КК-ВВ у крові при судинних операціях є припущення, що стінки вен, як, втім, і аорти, містять тільки одну ізоформу КК, а саме КК-ВВ.
КК-ВВ у сироватці крові незначно підвищується при деяких формах раку (легені, кишечника, сечового міхура, передміхурової залози), травмі серцевого м’яза, захворюваннях сполучної тканини.
Метастазування раку передміхурової залози супроводжується дуже високими цифрами активності КК-ВВ у крові. Дослідники сходяться на думці, що активність КК-ВВ може бути використана як неспецифічний маркер пухлинного процесу. Слід зазначити, що при пухлинному процесі активність КК-ВВ у крові наявна у формі макроКК-1.
Під час пологів КК-ВВ може збільшуватися в сироватці до 6 разів (джерелом є плацента).
МакроКК тип 1 виявляється в сироватці дорослих при захворюванні шлунково-кишкового тракту, аденомі, карциномі, ушкодженнях серцевого і скелетного м’язів і у стані з високою імовірністю летального наслідку. Іноді макроКК тип 1 трапляється у жінок старше 50 років.
МакроКК тип 2 виявляється в сироватці дорослих із тяжкою формою раку або хвороби печінки, а також у дітей з ураженням серцевого м’яза. Поява КК-Mt – погана прогностична ознака, серед таких хворих висока смертність.
Аналітичні методи, що використовуються в клінічній біохімії для визначення активності КК, можуть базуватися як на прямій, так і на зворотній реакції. У ході реакції можна визначити кількість креатину або концентрацію креатинфосфату. Першими методами визначення активності КК були методи кінцевої точки; на цей час домінують кінетичні методи.
Креатинфосфат у кислому середовищі гідролізує з більшою швидкістю, ніж АДФ і АМФ, при цьому утворюються креатин і ортофосфат. Далі кількість звільненого при гідролізі ортофосфату визначають за формуванням молібденового синього в реакції Фіске-Суббароу (прямий метод). У інших реакціях звільнений при гідролізі креатин взаємодіє з нінгідрином, діацетилом або α-нафтолом із формуванням флюорофорів. Флюоресценцію останніх вимірюють при специфічних довжинах хвиль на флюоресцентному спектрофотометрі.
На сьогодні для визначення активності КК використовують кінетичну УФ-спектроскопію – референтний метод, запропонований Олівер і співавт., який базується на зворотній реакції – кінетичному визначенні креатинфосфату, що утворюється в реакції. Збільшення абсорбції реакційної суміші при довжині хвилі 340 нм і кінетичному вимірюванні дозволяє визначити активність КК у великому інтервалі активності. Подальше вдосконалення методу стосується введення в реакцію АМФ для інгібування аденілаткінази і додавання N-ацетилцистеїну з метою захисту тіолових груп ферменту від окиснення.
Існує три загальновизнані методичні підходи до розділення ізоферментів КК: електрофорез, хроматографічні та імунологічні методи.
Електрофоретичним методом (на агарі, агарозі або ацетаті целюлози) можна розділити фракції КК. Візуалізація електрофоретичних смуг ізоферментів проводиться, як правило, з використанням НАДФН флюоресценції в ультрафіолетовій області спектра (360 нм). Тому ця процедура досить трудомістка й вимагає оснащення спеціальною технікою.
Іонообмінною або абсорбційною хроматографією розділяють ізоферменти КК на декілька фракцій. Ізоферменти КК, як правило, абсорбуються на гелі, з якого потім проводиться їх елюція буферами. Випускаються спеціальні комерційні мініколонки: метод простий і швидкий, основна складність – розділення фракцій при значному підвищенні кількості КК-ММ у патологічних випадках.
Імунологічні методи базуються на вимірюванні активності КК за наявності специфічної антисироватки, що містить моноклональні або поліклональні антитіла проти М або В субодиниць. Комерційні набори, що ґрунтуються на техніці преципітації, дозволяють виявляти КК-МВ за умов її істотного підвищення з коефіцієнтом варіації 10–20 %, проте ці тести виконуються швидко, як правило, не вимагають спеціальної апаратури і можуть використовуватися індивідуально, що є особливо зручним при експрес-діагностиці. Випускаються комерційні набори для фотометричного визначення КК-МВ, що базуються на визначенні активності КК при інгібуванні М-субодиниці. Норми для відсоткового розподілу активності ізоферменту КК-МВ у загальній КК-активності в цьому випадку істотно відрізняються від електрофоретичного розподілу.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 ... 20