Постулат "один ген - один поліпептид" створив концептуальну базу для аналізу зв'язку генотипу організму з його фенотипом. Але до вирішення проблеми структурної організації білків і ДНК, тобто до початку 50-х років, ця теорія не мала молекулярної основи. З розробкою нових методів аналізу білкової структури було встановлено, що кожен білок володіє унікальною лінійної амінокислотною послідовністю. Ця послідовність, звана первинної структурою, визначає характер укладки поліпептидного ланцюга з утворенням біологічно активної тривимірної форми. Таким чином, структура білка визначається йогоамінокислотної послідовністю, яка в свою чергу кодується генами. Доказом цього служить той факт, що мутації в гені призводять до зміни амінокислотної послідовності відповідного білка. Більш того, послідовності мутантних сайтів в генах і послідовності змінених амінокислот у відповідних білках колінеарні, тобто порядок їх прямування однаковий. Таким чином, було показано, що лінійне розташування нуклеотидів в ДНК і амінокислот в білках взаємопов'язано, тобто одна з характеристик генетичного коду встановлена.
Ідея генетичного коду увазі існування певного механізму переказу нуклеотидної послідовності ДНК в амінокислотну послідовність білків. З середини 50-х до початку 60-х років молекулярні основи генетичного коду та механізм його розшифровки при складанні поліпептидного ланцюга були встановлені. Розкриття цієї таємниці стало одним з монументальних досягнень молекулярної генетики. Несподівано код виявився дуже простим і абсолютно однаковим для всіх життєвих форм. Більше того, з'ясувалося, що універсальні і загальні правила трансляції генетично закодованих послань.
Генетичний словник складається з 64 кодонів, кожен з яких представлений трьома послідовно розташованими нуклеотидами в ланцюжку ДНК.61 з 64 кодонів кодують амінокислоти, причому кожен триплет - тільки одну амінокислоту. Один з цих триплетів має подвійну функцію: кодує амінокислоту метіонін і позначає початок фрагмента ДНК, що кодує білок. Кожен з трьох інших триплетів може служити сигналом закінчення послідовності, що кодує білок. Генетичний код виродилися, оскільки однією і тією ж амінокислоті може відповідати більш ніж один кодон; але, з іншого боку, код не двозначний, тому що будь-кодон позначає тільки одну амінокислоту. Якщо відомий словник кодонів, то перевести генну послідовність у відповідний білковий продукт не складає труднощів.
Для експресії гена у вигляді білкового продукту спочатку повинна відбутися транскрипція ДНК з утворенням РНК. Цей процес здійснюється за допомогою РНК-полімераз - ферментів, що каталізують синтез ланцюга РНК шляхом копіювання нуклеотидної послідовності одного ланцюга ДНК за допомогою компліментарного спарювання підстав. Гени, що кодують білки, детермінують синтез молекули "месенджер", або матричної РНК, званої так тому, що вона несе генетичну інформацію, закодовану у відповідному сегменті ДНК, і безпосередньо бере участь у складанні білків. Деякі гени не кодують жодних білків. При їх транскрипції утворюються не мРНК, а молекули РНК, необхідні для утворення зрілих РНК різного типу і для трансляції мРНК у білки.
Дослідження взаємодії РНК-полімераз та інших допоміжних білків транскрипції з ДНК розширило наші знання про специфічність і міцності міжмолекулярних взаємодій. Так, було показано, що здійснюються дуже точні молекулярні контакти між білками і специфічними групами нуклеотидів в ДНК, а це в свою чергу відкрило нові перспективи у дослідженні проблем експресії і регуляції генів. Ми коротко прокоментуємо, як такі взаємодії опосередковує регуляцію роботи генів.
У рамках вступної глави неможливо описати такою досконалий процес, як трансляція послідовності нуклеотидів матричної РНК в білкову ланцюг. Він дійсно дуже складний і складається з безлічі повторюваних етапів. Трансляцію молекул мРНК в білки каталізують рібонуклеопротеіновие частки, що містять більше 50 різних білків і три види молекул РНК. Синтез білкового ланцюга починається з приєднання рибосом до матричної РНК. Білкова ланцюг подовжується на одну амінокислоту, коли рибосома просувається уздовж молекули мРНК на один кодон. Ключовий момент трансляції - переклад генетичної інформації, закодованої в триплетних кодонах матричної РНК, в специфічні амінокислоти - залежить від компліментарного спарювання підстав. Кожна амінокислота приєднується до особливої, близької їй транспортної РНК, яка містить триплет, комплементарний кодоновому триплети в матричній РНК. Завдяки парування підстав між кодоном мРНК і антикодоном тРНК потрібна амінокислота займає своє місце в зростаючій поліпептидного ланцюга. За один цикл переміщеннярибосоми по всій довжині молекули мРНК, що кодує даний білок, утворюється одна молекула цього білка.
Вивчення експресії генів - тільки один з аспектів дослідження механізму їх дії. Інше пов'язане з регуляторними процесами, контролюючими час і ступінь експресії при різних умовах. Не дивно, що прогрес у розумінні механізму транскрипції і трансляції дозволив прояснити і проблему регулювання. Так, було показано, що у бактерій регуляція експресії генів відбувається диференційовано. Дійсно, при деяких умовах багато гени не експресуються зовсім, а ступінь експресії інших різниться на порядки. Однак зміна умов може призводити до активації мовчали раніше генів і, навпаки, до репресії активних. Це надає клітинам широкі можливості для мінливості, що забезпечує пристосованість їх фенотипів до умов середовища.
Експресія генів зазвичай регулюється на рівні освіти РНК. Як правило, ініціація транскрипції регулюється або репрессорнимі білками, блокуючими транскрипцію, або активаторний, необхідними для її запуску. У першому випадку експресія починається після зняття репресії в результаті модифікації білка-репрессора. У другому ген транскрибується тільки в тому випадку, якщо активаторний білок знаходиться у відповідному функціональному стані. Репрессорние і активаторний білки - не єдині засоби регулювання транскрипції. У деяких випадках білки - продукти генної експресії - самі служать регуляторами транскрипції власних генів. Відомі також випадки, коли на ефективність транскрипції впливають структурні зміни в ДНК. Освіта РНК може регулюватися і шляхом контролю швидкості елонгації або місця її закінчення, тобто транскрибувати може весь ген або якась його частина при наявності специфічного стоп-сигналу. Експресія генів може також регулюватися на рівні трансляції матричної РНК в білки. У цьому випадку специфічна регуляція теж зазвичай здійснюється на початкових етапах процесу декодування.
3. Регуляція експресії генів
3.1 Загальні принципи регуляції експресії генів
Активність генів визначається обсягом генопродуктов (РНК і білків). Ступінь активності генів називається їх експресією.
Всі гени клітини (і цілісного організму) можна розділити на дві групи: регуляторні та структурні. Регуляторні гени не транскрибуються, тобто у звичайних умовах їм не відповідає жоден з типів РНК. Структурні гени здатні транскрибироваться з утворенням РНК (матричної,рибосомальною, транспортної). У свою чергу, поділяються на структурні гени конститутивні і индуцибельные.
Конститутивні гени постійно включені: вони функціонують на всіх стадіях онтогенезу і у всіх тканинах. До конститутивним відносяться гени, які обслуговують матричні процеси (кодують тРНК, рРНК, ДНК-полімерази, РНК-полімерази, рибосомальные білки), гени, що кодують обов'язкові структурні компоненти клітини (наприклад, білки-гистоны), гени, контролюючі постійно протікають обмінні процеси (наприклад, гліколіз). Інакше кажучи, це «гени домашнього господарства», без яких клітини не можуть існувати.
Индуцибельные гени функціонують в різних тканинах на певних етапах онтогенезу, вони можуть включатися і вимикатися, їх активність може регулюватися за принципом «більше чи менше». Це тканеспецифичные гени, або «гени розкоші». До индуцибельным генам відносяться як гени, які контролюють хід онтогенезу (перемикачі, або диспетчери), так і гени, які прямо визначають структуру і функції компонентів клітини і цілісного організму.
(Потрібно зазначити, що суворої різниці між перерахованими групами генів не існує, оскільки один і той же ділянку ДНК може виконувати різні функції.
Існують индуцибельные гени, в нормі включені, і гени, що в нормі вимкнені. Включення нормально вимкнених індуцибельних генів називається індукцією, вимикання нормально включених - репресією.
Регулювання активності генів здійснюють молекулярно-генетичні системи управління. На індукцію і репресію можуть впливати різноманітні чинники, які називаються ефекторами. Одні з них прямо закодовані в геномі організму (наприклад, білки теплового шоку; див. нижче), інші утворюються як проміжні продукти обміну речовин, треті надходять у клітину ззовні в готовому вигляді із зовнішнього середовища або з інших клітин (тканин) організму, четверті утворюються в клітині під впливом фізичних факторів (високих температур, ультрафіолету) і т.д. Особливу групу складають ефекторів білки теплового шоку, які синтезуються в клітині при різних видах стресу (при підвищенні температури, при дії інших несприятливих факторів). Ці білки еволюційно консервативні, вони виявлені в самих різних організмів; ймовірно, вони є універсальними ефекторами.
Саме регуляцією активності генів пояснюється той факт, що, незважаючи на ідентичність генотипів клітин многоклеточного організму, вони значно різняться за будовою і функції. Переключення синтезу з одних білків на інші лежить в основі будь-якого розвитку, будь то репродукція вірусів в заражених клітинах, ріст і спороутворення у бактерій, розвиток ембріонів або диференціювання тканин. На кожному етапі цих процесів синтезуються специфічні білки.
Відомо кілька типів механізмів, за допомогою яких один і той же набір генів в неоднакових умовах життєдіяльності організму і на різних стадіях розвитку детермінує синтез білків. Регуляція експресії (вирази) генів може здійснюватися на кількох рівнях: генному, транскрипционном, трансляционном і функціональному. Перший з них пов'язаний зі зміною кількості або локалізації генів, контролюючих даний ознака. Другий визначає, які і скільки мРНК повинні синтезуватися в даний момент. Третій забезпечує відбір мРНК, що транслюються на рибосомах. Четвертий пов'язаний з алостеричній регуляцією активності ферментів. Нарешті, контроль дії генів може здійснюватися шляхом посттрансляційноїмодифікації поліпептидів, посттранскрипционной модифікації мРНК, та іншими шляхами.
Перш ніж детально проаналізувати перераховані механізми регуляції експресії генів, розглянемо детальніше транскрипційний рівень регуляції, щодо якого є велика кількість даних, отриманих головним чином на бактеріях.
3.2 Регуляція експресії генів у прокаріотів
Перемикання генів найкраще вивчено у прокаріотів (бактерій). Розглянемо механізми регуляції активності генів на прикладі лактозногооперона кишкової палички (Escherichia coli) - класичного об'єкта генетики мікроорганізмів. Одиницею регуляції експресії генів у прокаріотів єоперон.
Оперон - це ділянка бактеріальної хромосоми, що включає наступні ділянки ДНК: Р - промпротор, Про - оператор, Z, Y, А - структурні гени, Т- термінатор. (До складу інших оперонов може входити до 10 структурних генів і більш.)
Промотор - це регуляторний ділянка ДНК, який служить для приєднання РНК-полімерази до молекулі ДНК. В лактозном опероне приєднання РНК-полімерази відбувається за допомогою комплексу CAP-цАМФ (CAP - це специфічний білок; у вільній формі є неактивним активатором, цАМФ - циклоаденозинмонофосфат - циклічна форма аденозинмонофосфорной кислоти).
Оператор - це регуляторний ділянка ДНК, який здатний приєднувати білок-репрессор, який кодується відповідним геном lac. Якщо репрессор приєднаний до оператора, то РНК-полімераза не може рухатися вздовж молекули ДНК і синтезувати мРНК.
Структурні гени кодують три ферменту, необхідні для розщеплення лактози (молочного цукру) на глюкозу і галактозу. Молочний цукор лактоза - менш цінний продукт харчування, ніж глюкоза, тому в присутності глюкози зброджування лактози є невигідним для бактерії процесом. Однак при відсутності глюкози бактерія змушена переходити на харчування лактозою, для чого синтезує відповідні ферменти Z (β-галактозидазу), Y (галактозидпермеазу), А (тиогалактозидтрансацетилазу).
Термінатор - це регуляторний ділянка ДНК, який служить для від'єднання РНК-полімерази після закінчення синтезу мРНК, відповідної ферментам Z, Y, А, необхідним для засвоєння лактози.
Для регуляції роботи оперона необхідний ген cya, який кодує білок CYA, який каталізує утворення цАМФ з АТФ, Якщо в клітці є глюкоза, білок CYA вступає з нею в реакцію і переходить в неактивну форму. Таким чином, глюкоза блокує синтез цАМФ і робить неможливим приєднання РНК-полімерази до промотору. Отже, глюкоза є репрессором лактозного оперона.
Якщо ж у клітці є лактоза, то вона взаємодіє з білком-репрессором і перетворює його в неактивну форму. Білок-репрессор, пов'язаний з лактозою, не може приєднатися до оператора і не перегороджує шлях РНК-полимеразе. Таким чином, лактоза є індуктором лактозного оперона.
Припустимо, що спочатку в клітці є тільки глюкоза. Тоді білок-репрессор приєднаний до оператора, а РНК-полімераза не може приєднатися до промотору. Оперон не працює, структурні гени вимкнені.
При появі в клітці лактози і за наявності глюкози білок-репрессор відщеплюється від оператора і відкриває шлях РНК-полимеразе. ОднакРНК-полімераза не може приєднатися до промотору, оскільки глюкоза блокує синтез цАМФ. Оперон як і раніше не працює, структурні гени вимкнені.
Якщо ж у клітці є тільки лактоза, то білок-репрессор зв'язується з лактозою, відщеплюється і відкриває шлях РНК-полимеразе. У відсутності глюкози білок CYA каталізує синтез цАМФ і РНК-полімераза приєднується до промотору. Структурні гени включаються, РНК-полімеразасинтезує мРНК, з якої транслюються ферменти, що забезпечують зброджування лактози.
Таким чином, лактозный оперон перебуває під подвійним контролем індуктора (лактози) і репрессора (глюкози).
Загальні принципи регуляції активності генів
Крім лактозного оперона, у кишкової палички добре вивчені і інші опероны: триптофановый (trp), гистидиновый (his) та інші.
Загальні принципи регуляції активності генів у оперонах розробили Франсуа Жакоб і Жак Моно (1961; Нобелівська премія 1965). Згідно концепції Жакоба-Моно, одиницею регуляції активності генів у прокаріотів є оперон. Транскрипція групи структурних генів, регулюється двома елементами - геном-регулятором і оператором. Оператор часто локалізується між промотором і структурними генами; ген-регулятор може локалізуватися поруч з опероном або на деякій відстані від нього.
Якщо продуктом гена-регулятора є білок-репрессор, його приєднання до оператору блокує транскрипцію структурних генів, перешкоджаючи приєднанню РНК-полімерази до специфічної ділянки - промотору, необхідному для ініціації транскрипції. Навпаки, якщо білком-регулятором служить активний апоиндуктор, його приєднання до оператора створює умови для ініціації транскрипції. В регуляції роботи оперонов беруть участь також низькомолекулярні речовини - ефектори, виступаючі як індуктори або корепрессоры структурних генів, що входять до складу оперонов.
Розрізняють індуковані (включаються) і репрессируемые (вимикає) опероны залежно від типу впливу на їх роботу молекул-ефекторів.
У індукованих оперонов ефектор приєднується до білка-репрессору і блокує його зв'язування з оператором, перешкоджаючи транскрипції структурних генів. Такий тип регуляції роботи оперона називають негативним. При негативному контролі ефектор, який є корепрессором, приєднується до неактивного репрессору і активує його. В результаті репрессор набуває здатність приєднуватися до оператора і тим самим блокувати транскрипцію оперона. Таким чином, при негативному контролі ефектор зв'язується з репрессором, що призводить до його інактивації або активації і відповідно індукує або репресує транскрипцію оперона.
Поряд з цим, індуковані опероны можуть перебувати під позитивним контролем регулювання, при якому ефектор зв'язується з регуляторним білком і активує його. Активний апоиндуктор приєднується до оператора, що забезпечує можливість транскрипції оперона. Обидва типи контролю регуляції діють і щодо репресованих оперонов. При позитивному контролі функціонування репрессируемого оперона корепрессорзв'язується з активним апоиндуктором. Такий комплекс не може приєднуватися до оператора, і структурні гени не транскрибуються. При позитивному контролі ефектор приєднується не до репрессору, а до апоиндуктору, що дозволяє, або, навпаки, блокує транскрипцію в залежності від того, яку форму (активний або неактивний) набуває апоиндуктор в результаті зв'язування з ефекторів. Оскільки при транскрипції оперона, що складається з кількох структурних генів, утворюється один загальний транскрипт у вигляді молекули полицистронной мРНК, всі ці гени експресуються координовано.
Особливі типи регуляції активності генів
У прокаріотів процеси транскрипції (синтез мРНК на матриці ДНК з допомогою РНК-полімерази) і трансляції (синтезу білка на матриці мРНК при участі рибосом і тРНК) тісно пов'язані між собою: синтез матриці мРНК ще не закінчений, а синтез білка на цій матриці вже починається. Таким чином, мРНК одночасно пов'язана і з РНК-полімеразою і з рибосомой.
В результаті регуляція активності деяких оперонов (наприклад, his-оперона) часто пов'язана з активністю спеціального контролюючого елемента - аттенюатора (від англ. attenuate - послаблювати), що представляє собою лидерный ділянка ДНК, локалізований у разі his-оперона між оператором і першим структурним геном. У присутності корепрессора (особливим чином модифікованою гистидинового тРНК) аттенюатор забезпечує терминацию (обрив синтезу) мРНК на початку оперона і, таким чином, транскрипції структурних генів не відбувається.
Атенюатори широко поширені серед прокаріотів. Однак поряд з аттенюаторами, виконують функцію негативно чинного регулятора транскрипції, існує і позитивний регулятор his-оперона, присутність якого полегшує приєднання РНК-полімерази до промотору.
Слід додати, що транскрипція може здійснюватися з різних промоторів. Розрізняють сильні промотори, до яких РНК-полімеразаприєднується порівняно легко, і слабкі промотори, до яких РНК-полімераза приєднується тільки з допомогою допоміжних часток (їх зазвичай позначаються символом σ). Чим більше промоторів задіяно в процесі транскрипції, тим більше утворюється РНК. Точно також існують термінатори з різним ступенем спорідненості до РНК-полимеразе. Від одних термінаторів РНК-полімераза від'єднується без особливих труднощів, а від інших - з допомогою допоміжних часток (їх зазвичай позначають символом ρ).
1 2 3