1 2 3 4 5 Ім'я файлу: Розробка отримання глюкоізомерази із Lactobacillus brevis та її Розширення: docx Розмір: 553кб. Дата: 26.06.2020 скачати Таблиця 11 - _Склад
Молочну сироватку отримували в умовах лабораторії, для чого в 1 л підігрітого до 60-70°C молока з жирністю 2,5% при постійному помішуванні додавали 2,5-3 мл 70% оцтової кислоти (есенції), після створаживания згусток казеїну відокремлювали, а сироватку фільтрували через ватно-марлевий фільтр і використовували для приготування середовища. Невикористаний залишок сироватки можна зберегти, піддавши його автоклавуванню при 115 °C протягом 20 хв. Дріжджовий аутолізат отримували по Н.І. Розанову (Лабораторна діагностика захворювань сільськогосподарських тварин. М., Держ., Через у с.-г. літератури, 1952. - С.91). Капустяний відвар готували по Кваснікова (Квасніков Є.І., Нестеренко О.А. Молочнокислі бактерії та шляхи їх використання. - М .: Наука, 1975. - С.65). Взяті компоненти живильного середовища змішують в колбі і доводять до кипіння і кип'ятять 2-3 хв до повного розплавлення агару, фільтрують через ватно-марлевий фільтр, розливають у флакони і автоклавують 20 хв при 0,5 атм, після охолодження середовища до 45-50 °С в нього вносять оцтову кислоту і розливають в чашки Петрі. Готові для використання середовища прозорі, світло-коричневого кольору, з приємним молочно-рослинним з оцтовим відтінком запахом, з pH 5,3-5,5. Новизна заявленої пропозиції полягає в тому, що розроблене живильне середовище, що володіє вираженими селективними властивостями по відношенню до лактобактерій, на якій вони дають хороший зростання і формують типові для них колонії розміром 1,5-2 мм. Селективні властивості середовища обумовлені вмістом в його складі оцтової кислоти, до якої лактобактерії стійкі, в той час як інші бактерії (стафілострептококки, ентеробактерії, псевдомонади, бацили і ін.) до цієї речовини чутливі. 1.3. Характеристика фермента глюкоізомерази Глюкоізомераза (glucoisomerase) [гр. glykys - солодкий, iso - рівний і meros - частина] - фермент класу ізомераз, що каталізує ізомеризацію глюкози у фруктозу. У промисловості Г. виробляють за допомогою мікробіологічного синтезу. Препарати глюкозоізомерази Виробництво препаратів глюкозоізомерази викликано необхідністю постійно розширювати об‘єми випуску цукрових речовин з харчовою метою. Джерела отримання і властивості глюкозоізомерази В промисловості в якості продуцентів глюкозоізомерази використовуються мікроорганізми, які відносяться до родів Streptomyces, Aerobacter і Lactobacillus. Субстратами для ферментативної ізомерації виступає глюкоза, ксилоза та рібоза. Існує кілька видів глюкозоізомеруючих ферментів. Згідно Номенклатури ферментів, у підклас 5.3.1 «Ферменти, які каталізують взаємоперетворення альдоз і кетоз» входять дев‘ятнадцять ферментів, чотири з яких мають здатність каталізувати ізомерацію субстрата у фруктозу і ксилозу. До них відносяться: - ксилоізомераза (D-ксилозокетолізомераза, КФ 5.3.1.5), яка каталізує перетворення D-ксилози у D-ксилулозу; - маннозоізомераза (D-маннозокетоізомераза, 5.3.1.7), яка каталізує перетворення D-маннози у D-фруктозу; - глюкозофосфатізомераза (D-глюкозо-6-фосфаткетолізомераза, КФ 5.3.1.9), яка каталізує перетворення D-глюкозо-6-фосфату у D-фруктозо-6-фосфат; - глюкозоізомераза (D-глюкозокетолізомераза, КФ 5.3.1.18), яка каталізує перетворення глюкози у D-фруктозу. Усі чотири ферменти, окрім основної реакції, каталізують реакцію ізомерації D-глюкози у D-фруктозу. З них лише перший знайшов практичне застосування у виробництві ГФС і фруктози, так як цей фермент не потребує присутності арсената і НАД+ у реакційному середовищі, а головне, ксилоізомераза володіє значно вищою термостабільністю. Цей фермент отримав робочу назву глюкозоізомераза. Дійсним субстратом для глюкозоізомерази є а-D-глюкопіраноза, яка знаходиться у рівновазі з b-D-глюкопіранозою у співвідношенні 1:2. b-D-глюкопіраноза не піддається ізомерації, і вона не заважає процесу, так як глюкоізомераза пов‘язується з нею, тому b-D-глюкопіраноза є неконкурентним інгібітором реакції. Реакція ізомерації глюкози у фруктозу зворотнім процесом, але зворотня реакція протікає значно складніше прямої. Глюкоізомерази є термостабільними ферментами, оптимум дії яких пролягає у інтервалі температур 60-80 ℃. Ферменти проявляють стабільність у широкому діапазоні pH (4,5-11) з найбільшою активністю при pH = 7-9. Отримання препаратів глюкоізомерази У переважній більшості випадків глюкоізомераза є внутрішньоклітинним ферментом, накопичення якого у клітині співпадає з накопиченням продуцентів біомаси і зазвичай відповідає 16-20 год. зросту культури. Тому при виробництві глюкоізомерази цільовим продуктом є біомаса. Глюкоізомераза є індуцибельним ферментом; у якості індуктору зазвичай використовується ксилоза у вигляді ксилозовмісної сировини, яка містить ксилозу (солома, рисові і пшеничні висівки, кукурудзяні качани, зернове та бавовняне лушпиння). Але продуценти потребують і інших джерел вуглеводу (глюкоза, крохмаль та ін.). У якості джерела азоту може бути використаний як мінеральний, так і органічний азот. Необхідними компонентами поживного середовища є іони магнію, які включають у вигляді MgSo4*7H2O (від 0,025 до 0,05%), і кобальту - у вигляді CoCl2*6H2O (0,005-0,024%). Під час культивування для актиноміцетів використовується температура від 25 до 45 °С., для бактеріальних культур діапазон температур ширший - від 28 до 60 °С.. Середовища, які використовують для вирощування продуцентів, мають початковий pH від 6 до 8, які зміцнюються у ході зросту культури. Кількість посівного матеріалу і тривалість культивування визначаються видом продуценту. Бактеріальні культури зростають швидко, посівний матеріал отримується в 1-2 етапи, і його дозування не перевищує 1%. Актиноміцети потребують високої дози посівного матеріалу (від 10%), тому отримання виробничої культури складається з 3-4 етапів. Виробництво препаратів глюкоізомерази у виробництві здійснюється двома способами: виділенням ферменту з біомаси продуценту шляхом повного руйнування клітин; фіксуванням ферменту всередині клітини і використанням цієї біомаси задля ізомерації D-глюкози у D-фруктозу. Перший способ складніший, так як звичайні методи руйнування клітин (розтирання з кварцовим піском, обробка розчинниками, автолиз та ін.) не призводить до остаточного виходу ферменту із клітини. Різке збільшення глюкоізомеразної активності у безклітинних екстрактах відбувається лише за умови додавання до клітин, що обробляються лізоцимом (N-ацетілмурамидглюканогідролази, КФ 3.2.1.17). Перший спосіб застосовується для виділення ферменту з метою дослідження його властивостей і отримання іммобілізованих препаратів, а більшість промислових технологій базуються на другому способі отримання глюкоізомеразних препаратів. Фермент, який виділили із клітини можно очистити звичайними засобами. Відмінною особливістю є термообробка ферментного розчину за якої баластні білки денатурують і осаджуються. Виділення ферменту у присутності іонів кобальту і магнію значно підвищують стійкість глюкоізомерази, що, вочевидь, пов’язанно зі стабілізацією четвертичної структури. Молекулярна маса ферментів у різних мікроорганізмів різниться, але більшість із них має розміри від 160 до 200 кДа. Фермент застосовують тільки у іммобілізованому вигляді. Використовують два способи іммобілізації препаратів: фіксування ферменту у клітині продуценту і прикріплення її до носія; виділення ферменту із клітини у розчиненому стані з наступною його іммобілізацєю на носії. 1.4. Виготовлення глюкозно-фруктозних сиропів. Актуальність та дослідження ринку. Інтенсивний розвиток нового напрямку в науці про харчування - функціональне харчування - вимагає створення підсолоджувачів нового покоління, які мають не тільки чистий солодкий смак, високі технологічні характеристики і безпечні, але й здатні проявляти функціональні властивості. Внаслідок розвитку біотехнології розроблений багатостадійний процес одержання з крохмалю цінного продукту - глюкозно-фруктозного сиропу (ГФС). Світове виробництво його досягає 6,6 млн т, з яких близько 85 % зосереджено у США, Японії та Канаді. У США ГФС активно витісняє рідкий цукор у промисловості і загальне виробництво його перевищує 5 млн т. У 2005 р. в Дніпропетровську був введений в експлуатацію новий завод з комплексної переробки зерна кукурудзи - ЗАТ "ИнтерКорн Корн Процессинг Индастри". Підприємство запропонувало ринку не тільки високоякісну крохмальну патоку, але й сиропи з різним вуглеводним складом. Завдяки схемі подвійного ферментативного гідролізу гарантується широкий асортимент і висока якість глюкозних, мальтозних і глюкозно-фруктозних сиропів. Ці сиропи не містять цукрози, підсилюють смак і аромат натуральних компонентів. На перспективу до початку 2008 р. підприємство буде переробляти до 300 тис. т зерна кукурудзи на рік. У січні 2008 р. планують запустити вже третю чергу заводу, яка дозволить виробляти технологічно складний і поширений в світі продукт - глюкозо-фруктозний сироп 55. Частина сиропу буде випускатись у вигляді порошку. Понад 55 % натуральних підсолоджуючих речовин, що виробляються у США, використовуються у вигляді кукурудзяного сиропу з високим вмістом фруктози, споживання якого на одну особу в країні складає 19,5 кг на рік. Для виготовлення такого сиропу в США щорічно переробляється 13,6 млн т зерна кукурудзи. З неї готують різноманітні продукти, у тому числі бродіння: етанол, органічні кислоти, амінокислоти, поліоли, а також трегалозу і полімолочну кислоту. Для виробництва ГФС використовують високоякісний крохмаль з вмістом білків не вище 0,4 %, у тому рахунку розчинних - до 0,03 %. Перед розрідженням суспензію розварюють, нагріваючи її за допомогою гострої пари до 85 °С на протязі 25 с. Розрідження може вестись одностадійно з використанням термостабільності а-амілази за температури 105-110°С, або у дві стадії (85°С) з внесенням амілосубтиліну. Після розрідження гідролізат містить 34-35 % СР, а його глюкозний еквівалент (ГЕ - відношення кількості редукуючих речовин у перерахунку на глюкозу до кількості сухих речовин продукту, виражене у відсотках) - 18-20 %. Технологічна схема (рис. !!)одержання ГФС включає такі операції: ОЛІЧКА СХЕМУ НАПЕЧАТАТИ САМІЙ!!!! Оцукрювання розрідженого крохмалю проводять за допомогою глюкоамілаз (глюконигрін Г20х, глюкоаваморін Г20х) з рН 4,5 і температурою 60°С у місткостях, де розчин перемішується і підігрівається протягом 48-72 год. Процес оцукрювання закінчують після того як ГЕ становитиме 97-98 %, тобто 96-97 % глюкози на суху речовину. Нерозчинні домішки (білки, клітковину тощо) відфільтровують з нанесенням на фільтрувальну поверхню фільтрувального порошку (перліт, кізельгур тощо). Розчинні домішки (азотні речовини, різні органічні і неорганічні сполуки) видаляють послідовним обробітком сиропу активованим вугіллям і іонообміном. Сироп послідовно пропускають крізь іонообмінні колони, які містять катіоніт-аніоніт-катіоніт-аніоніт. Очищений глюкозний сироп до ізомеризації згущають випаровуванням за температури не вище як 60°С, поки вміст СР не стане 45-50 %. Одночасно із сиропу видаляють кисень, який інгібує ізомерази глюкози. Вміст азотистих речовин у сиропі допускається до 0,06 %, а іонів кальцію - 1 х х 10-6 моль/дм3. У зв'язку з тим, що іони кальцію знижують ефективність дії ферментів, їх нейтралізують додаванням іонів магнію. Ізомеризацію глюкози здійснюють пропусканням сиропу крізь шар іммобілізованої (закріпленої на носії) глюкозоізомерази. Носіями є желатин у гранулах, полістирол, модифікована целюлоза, діоксид титану. Глюкозоізомеразу отримують з мікроорганізмів, наприклад, родини Streptomyces, Lactobacillus або Artrobacter. Завдяки цьому кількість фруктози у глюкозофруктозному сиропі досягає 42 % і отримують звичайний сироп (1 покоління). Крім того виробляють збагачений сироп, що включає 55-60 % фруктози (2 покоління) і високофруктозний з вмістом 90-95% фруктози (3 покоління). Світовий досвід показує, що глюкозно-фруктозний сироп може замінити в кондитерських виробах близько 20 % цукру. Завдяки цьому сиропу у цукерках, зефірі та інших виробах довго зберігається свіжість. Для отримання сиропу, що містить 45% глюкози, іонообмінною хроматографією відділяють глюкозну фракцію, яку потім повертають на стадію ізомеризації. Фракцію, яка включає 90% фруктози, змішують з початковим сиропом з таким розрахунком, щоб у готовому продукті містилось 55% фруктози. Солодкість такого сиропу аналогічна показнику інвертного цукру. За умови хімічної рівноваги неможливо ізомеризувати у фруктозу більш як 50 % глюкози, яка є в розчині. Ізомеризацію здійснюють за температури 58-65°С, рН 7,5-8,2 протягом 20-24 год., що забезпечує накопичення близько 42 % фруктози в ізомеризованому сиропі. Глюкозно-фруктозний сироп можуть випускати марок ГФС-5, ГФС-10, ГФС-20, ГФС-30, ГФС-42. Таблиця 1.5 - Фізико-хімічні та органолептичні показники сиропів
Глюкозно-фруктозний сироп марки ГФС-42 характеризується декстрозним еквівалентом 97, показником заломлення (20°С) - 14632-14656, кольоровістю (од. ЯБи) не більше початкова 25, після 30 діб (1 30°С) - 50. Він містить 70,5-71,5 % сухих речовин, до 0,6 мг/кг Б02, золи до 0,1. За органолептичними показниками ГФС-42 являє собою в'язку рідину, солодку без присмаку і запаху. У розрахунку на суху речовину сироп містить 42-43 % фруктози, 50-54 % глюкози, 2-3 % мальтози, 2 % мальтотриози і 1 % вищих цукрів. Тривале зберігання сиропу здійснюється в ізольованих місткостях з нержавіючої сталі з підігрівом за температури 28-35°С. Частину ГФС-42 концентрують до досягнення рівня сухих речовин 72 % (ГФС-72). Він включає 42-43 % фруктози і 51- 54 % глюкози, а решта 5 % цукрів представлені в основному ди-, трицукридами і вищими цукрами. Готовий сироп являє собою слабков'язку безбарвну рідину, без запаху із солодким, властивим і за солодкістю повністю відповідає цукровому розчину. Більшість ГФС підсилюють фруктові, цитрусові і пряні аромати, сприяють попередженню черствіння борошняних кондитерських виробів. Розглянуті сиропи особливо ефективно використовують у виробництві варення, джему і цукатів. ГФС обмежує процес набухання колоїдів борошна, тому з підвищенням кількості сиропу зменшується потреба в цукрі. Завдяки гігроскопічності фруктози, додавання ГФС підвищує гігроскопічність і здатність до набухання готових виробів, вони стають м'якими і розсипчастими, їх якість підвищується. Глюкозно-фруктозний сироп також отримують з інулінвмісної сировини. У ньому значно зменшується частка глюкози і відповідно зростає частка фруктози до 97 %. В інуліні присутні фрукта-ни зі ступенем полімеризації 1-34. де полімеризацію фруктанів здійснює фермент Р-(2,1)-фруктан l-.фруктангідролаза (інуліна-за), яка гідролізує полімер до фруктози і цукрози. Інулінази виявлені у мікроорганізмах (грибів, дріжджів, бактерій). Промислове значення мають гриби роду Aspergillius і дріжджі роду Kluy-veromiyces. Виділені також бактеріальні інулази, які характеризуються високою термостабільністю. 1 2 3 4 5 |