2.3. Використання амілолітичних ферментів у різних галузях господарства
У виробництві спирту як основний ферментовмісний матеріал раніше застосовували солод, який від початку виникнення спиртової промисловості використовували для оцукрювання крохмалю сировини і який з успіхом було замінено на культури мікроміцетів з активним амілолітичним комплексом ферментів. Застосування у процесі виробництва спирту грибної амілази замість солоду дозволяє: а) зекономити десятки тисяч тонн високоякісного зерна; б) підвищити вихід спирту; в) різко скоротити в часі процес одержання ферментного препарату. Як відомо, для одержання активного зернового солоду потрібно 7–8 діб, для вирощeвання ж культури гриба й отримання з неї препарату ферменту — кілька десятків годин; г) зменшити кількість виробничих площ, а також усіх видів енергії.
У пивоварінні амілази використовують замість зернового солоду. Смакові якості пива при цьому практично не змінюються. Для застосування у пивоварінні найбільш придатними є ферменти грибного походження (A. oryzae), що дозволяє заощадити десятки тисяч тонн ячменю. Якщо у виробництві пива зменшити кількість солоду і збільшити кількість ферментного препарату до 4–5%, то можна взагалі обійтися без солоду і з несолодженої сировини одержати сусло, яке майже не відрізнятиметься від сусла, виготовленого із солоду. Якщо затір у процесі такого способу виробництва піддати гідротермічній обробці певного режиму, то він набуває смаку й аромату солоду.
Амілолітичні ферменти також використовують у крохмале-патоковій промисловості для виготовлення глюкозної і мальтозної патоки. У цьому разі застосування амілаз різноманітне. Насамперед, за їхньою участю може бути отримана розчинна форма крохмалю. За допомогою бактеріальних і рослинних амілаз вдається одержати мальтозну і глюкозну патоки, зокрема з кукурудзяного і маїсового борошна, а також чисту глюкозу. Різні види паток використовують головним чином у кондитерському виробництві, де вони перешкоджають кристалізації сахарози і лактози, поліпшують консистенцію виробів і збільшують терміни їх зберігання, а також у виробництві морозива, консервованих фруктів і варення, безалкогольних напоїв, столових сиропів тощо.
У крохмалепатоковій промисловості ферментативний гідроліз має переваги перед кислотним завдяки ряду переваг, таких як специфічність реакції, стабільність продуктів, нижчі енергетичні потреби.
У хлібопекарській промисловості амілолітичні ферментні препарати застосовують як біологічні поліпшувачі якості хліба: значно покращуються смак, аромат, забарвлення кірки, збільшується питомий об’єм, пористість, вміст цукру. Крім того, вони інтенсифікують біохімічні й мікробіологічні процеси, прискорюючи процес тістоведення. Α-Амілазу А. оrуzae додають у разі недостатнього вмісту амілаз у борошні. Амілаза гідролізує крохмаль тіста, а утворювана при цьому мальтоза слугує субстратом для пекарських дріжджів у процесі заквашування. Низька термостійкість α-амілази А. оrуzae має позитивне значення, дозволяє уникнути деградації м’якуша у процесі випікання.
У виробництві різних виробів із круп’яних продуктів амілази застосовують для попереднього оброблення сировини, з якої виробляють харчовий продукт у вигляді пластівців чи зерен або круп’яних концентратів. Готові продукти після гідролізу набувають поліпшених смакових якостей, збагачуються розчинними цукрами, компоненти їх краще перетравлюються і засвоюються.
У виробництві овочепродуктів, зокрема пюре, супів, різних форм сушених овочів, крохмаль так само модифікують. Процес має ряд технологічних переваг: для супів і пюре — необхідне розрідження за збереження сухої речовини у продуктах; для сушених овочів — деяке прискорення процесу висушування. В усіх випадках повніше використовується сировина.
Відходи кондитерської промисловості часто містять значні кількості крохмалю, особливо це стосується відходів виробництва цукерок. За допомогою бактеріальних і грибних амілаз можна виділити з них цукри і використовувати їх.
Дитяча їжа. На сьогодні в деяких країнах налагоджено випуск нових харчових продуктів, які попередньо оброблені ферментами. Так, під час виготовлення дитячої їжі крохмаль чи білки частково гідролізують амілолітичними чи протеолітичними ферментами. Це значно полегшує перетравлення і засвоєння зазначених цінних речовин в організмі дитини і, крім того, поліпшує смакову якість їжі, що в даному разі також є дуже важливим.
Вироби із фруктів. У виробництві різної продукції з фруктів — соків, екстрактів, деяких сортів варення, фруктових пюре — застосовують грибні амілази для повного розщеплення в них крохмалю. Залишки крохмалю можуть призводити до поступового загусання продуктів, деякого помутніння соків, екстрактів, погіршення їхнього товарного вигляду.
Амілази можна широко використовувати і в легкій промисловості. Так, у текстильному виробництві їх застосовують для розшліхтування рослинного волокна перед відбілюванням і фарбуванням. Вихідний продукт — сувора тканина — містить 5% крохмалю і чимало інших домішок, які треба видалити, зробивши тим самим тканину м’якою, здатною змочуватися, краще відбілюватись і зафарбовуватись. Найпридатнішими для цієї мети виявилися бактеріальні амілази. Для фарбування текстильних виробів, навпаки, необхідним є крохмаль. Його вводять у друкувальну фарбу у вигляді загущувача, для того щоб надати фарбі клейкості, пластичності й чіткості. Крохмаль, що його використовують у цьому разі, має бути розчинним. Для цього його деякою мірою гідролізують за допомогою амілолітичних ферментів (краще бактеріального походження, утім можна й рослинного).
У паперовій промисловості за допомогою амілаз одержують спеціальний крохмаль, який додають під час проклеювання паперу. Ця операція додає паперу пружності, щільності, глянцю, збільшує його міцність.
Амілази використовують і в промисловості очищення. За їх участю готують розчинний крохмаль, який застосовують для підкрохмалювання білизни. І навпаки, очищуючи білизну й одяг, можна легко розщепити крохмальний шар і швидко видалити його разом із плямами. Під час ремонтних робіт за допомогою амілаз знімають зі стін шпалери, що були приклеєні крохмальним клейстером.
Амілази, разом із протеазами й ліпазами, широко використовують у виробництві мийних засобів. Амілази полегшують видалення плям, які містять крохмальні речовини, наприклад, від макаронних виробів, картоплі, шоколаду, дитячої їжі. Крохмаль, що висихає, важко видаляється при середніх і низьких температурах прання, особливо в разі застосування мийних засобів середньої лужності. Крохмаль прилипає до поверхні тканини, відіграючи роль клею для інших компонентів забруднень. Амілаза гідролізує крохмаль у декстрини і цукри, які легко розчиняються у мийному розчині.
3. Матеріали та методи досліджень:
3.1. Опис субстратів (будова, властивості), на які діють амілолітичні ферменти
Субстратами для дії амілаз є крохмаль, що складається з амілози і амілопектину, продукти часткового гідролізу крохмалю і глікоген. Крохмаль - рослинний полісахарид з дуже складною будовою. Це двухкомпонентне з'єднання, що складається з 13-30% амілози і 70-85% амілопектину. Обидва компоненти неоднорідний, їх молекулярна маса (М. м.) коливається в широких межах і залежить від природи крохмалю. Амілоза - це нерозгалужувальний полімер, в якому залишки глюкози з'єднані a-1, 4-глікозидним зв'язком; ступінь полімеризації близько 2000. У «аномальних» амілозах з однією-двома a-1, 6-зв'язками полімеризації може зрости до 6000. Амілоза практично не володіє відновлювальною здатністю, так як в кожній молекулі амілози є тільки одна вільна альдегидная група.
Молекула амілози являє собою розтягнуту спіраль, крок якої становить 10,6 А і в кожний виток входить 3 залишку глюкози. Максимальна довжина молекули амілози досягає 7000 А. У розчині спіраль стискається за рахунок збільшення витка, в якому вже бере участь 6 залишків глюкози. При входженні молекул йоду в спіраль амілози виникає характерний синій колір. Строго говорити про величину молекули амілози не можна, отже навіть з одного зразка крохмалю витягується амілоза, з величиною молекули від 500 до 2000 залишків глюкози. Амілопектин має велику молекулярну масу, ніж амілоза, і більш складну будову. Це розгалужений полісахарид. Передбачається, амілопектин галузиться дихотомічно, отже число кінцевих ланок завжди на одиницю більше числа ланок, що дають розгалуження, а сума цих чисел дає загальне число ланок по всьому ланцюгу.
3.2. Опис методики визначення активності амілаз
Як правило, ферменти присутні в біологічних об'єктах в мізерно малих концентраціях, тому більший інтерес представляє не кількісний вміст ферментів, а їх активність по швидкості ферментативної реакції (по убутку субстрату або накопичення продуктів).
Для визначення ферментативної активності ферментів застосовуються такі методи, які дозволяють безперервно стежити за ходом перетворення у часі: спектрофотометричні методи, потенціометричні, полярографічні і т.п. Для вимірювання швидкості ферментативної реакції необхідно вибрати буфер, який не гальмує досліджувану активність і забезпечує підтримку рН розчину, близької до оптимальної для даного ферменту. Реакцію проводять при температурі, що лежить в більшості випадків в межах 25-40 є С. При дослідженні ферментів, що вимагають присутності кофакторів (іонів металів, коферментів та ін), концентрація яких може знижуватися в міру очищення ферменту, в реакційну суміш слід додавати відсутні кофактори, наприклад солі металів, АТФ, НАДФ і т.п. Також для визначення активності ферментів вводять стабілізатори до складу досвідчених сумішей.
Спектрофлюрометричні методи
Для цілей визначення ферментів можуть бути використані не тільки вимірювання поглинання світла, але також вимірювання флуоресценції - спектрофлюрометричні методи. Таке визначення активності ферменту в ряді випадків по чутливості перевершує спектрофотометричні методи на цілий порядок величини. Деякі коферменти і субстрати мають сильну флуоресценції. НАД та НАДФ у відновленому стані мають сильну флуоресценцію і не флуорисцують в окисленому стані.
Колориметричні (фотометричні) методи
В основі цих методів лежить вимірювання за допомогою візуального або фотоелектричного колориметр пофарбованого продукту, що утворюється при взаємодії субстрату або продукту дії ферменту зі специфічними реактивами, які зазвичай додаються в фіксовану дослідну пробу, взяту після зупинки ферментативної реакції. Ці методи дуже різноманітні. Розроблені кількісні методи, засновані на біуретової реакції, при якій склад білку, очевидно не повинен позначатися на результатах визначення, тому що ця реакція на пептидні зв'язки, а не на бічні групи в білку. Метод Горнелла і співавторів, заснований на вимірюванні смуги поглинання в області 550-650 нм, використовується для визначення значних кількостей (1-10 мг) білка в пробі. Пропонуються біуретовим мікрометодом, засновані на поглинанні ультрафіолетових променів мідно-білковими комплексами: вони дозволяють визначати 0.1 - 2.0 мг білка в пробі. Число небілкових речовин, які можуть впливати на визначення за допомогою біуретової реакції, невелика, але слід вносити поправки на ті речовини, які присутні у високих концентраціях (солі амонію, сахароза). Найбільш цінними є ті фотометричні методи, які дозволяють стежити в часі за ходом ферментативної реакції без її припинення щодо зміни забарвлення хромогенного субстрату або доданого індикатора. Метод Толіна і Чіокальто, запропонований для визначення кількості білка, заснований на хромогенних природі деяких бокових груп амінокислот, а також на присутності в білках пептидних зв'язків. Цей метод має високу чутливість (на пробу досить 0.01 - 0.1 мг білка), але багато небілкових речовини заважають визначенням.
В даний час для визначення кількості білка широко користуються вимірюваннями інтенсивності поглинання світла при 280 нм, що обумовлено присутністю в білку ароматичних амінокислот. Кількість цих амінокислот у різних білках по-різному і, отже, інтенсивність неоднакова. У кюветі товщиною 1 см у розчину, який містить 1 мг "усередненого" білка в 1 мл, оптична щільність дорівнює 1 при довжині хвилі 280 нм. Нуклеїнові кислоти поглинають при 280 нм, але можна зробити поправку на їх присутність, проводячи вимірювання і при 260 нм і при 280 нм. Дуже важлива швидкість вимірювання активності ферментів. Те ж відноситься і до вимірювання кількості сухого залишку або кількості білка. Тим самим віддають перевагу швидкому метод визначення білка шляхом вимірювання величини поглинання при 280 нм. Виграний час важливіше, за рахунок того, що питоме поглинання виділяється білка іноді значно відрізняється від середньої величини поглинання суміші білків, присутніх у вихідному матеріалі.
Спектрофотометричні методи
Спектрофотометричні методи засновані на поглинанні світла в певних ділянках спектру багатьма сполуками, які є активними групами ферментів, субстратами або продуктами реакції. Положення максимуму поглинання при певній довжині хвилі визначається наявністю в досліджуваному матеріалі певних груп - аналітичних форм. Для вимірювання спектрів використовують спеціальні прилади - спектрофотометри, фотометричні абсорбціометри та ін Цей метод відрізняється високою чутливістю, швидкістю визначення, малим витрачанням ферменту і реактивів і дозволяє стежити за перебігом реакції у часі. Для цього реакційну суміш поміщають в кювету, вставлену в термостатуємий кюветотримач. Через малий проміжок часу після додавання ферменту (або субстрату) і швидкого перемішування вимірюють поглинання при довжині хвилі, характерної для використовуваного субстрату або кінцевого продукту, що утворюється в даній реакції. За допомогою спектрофотометричних методу можна вимірювати безпосередньо концентрацію деяких ферментів (після достатньої очищення) за величиною характерних максимумів поглинання міцно пов'язаних коферментів (простетичних груп). Необхідно мати довільно вибрану одиницю ферменту, за допомогою якої можна було б кількісно виразити чистоту і активність різних фракцій. У більшості випадків вибір одиниці залежить від обраного методу визначення. У разі спектрофотометричних методу такою одиницею може служити кількість ферменту, що викликає певну зміну в оптичної щільності за певний час за даних умов досвіду; якщо визначається продукт реакції, то одиницею буде кількість ферменту, що викликає утворення певної кількості речовини в хвилину, і т.д . Тоді питому активність ферменту, яка є мірилом чистоти ферментного препарату, виражають числом одиниць в 1 мг речовини (білка).
Манометричні методи і інші методи
Ці методи використовуються при визначенні активності ферменту в тих випадках, коли в досліджуваних реакціях один з компонентів знаходиться в газоподібному стані. До таких реакцій відноситься головним чином ті, що пов'язані з процесами окислення і декарбоксилювання, що супроводжуються поглинанням або виділенням кисню і вуглекислоти, а також реакції, в яких виділення або зв'язування газу відбувається в результаті взаємодії продуктів ферментативного перетворення з доданим до системи реактивом. Спостереження за ходом реакції у часі проводиться в спеціальних приладах - манометричних апаратах Варбурга.
Інші методи: сюди відноситься великий ряд методів, що включають поляриметрії, віскозиметрі, потенції-і кондуктометричні вимірювання і т.п. Також визначення активності можна виконувати, використовуючи методи хроматографії та електрофорезу на папері. Ці методи високочутливі і специфічні, що робить їх у багатьох випадках незамінними; вони дозволяють значно скоротити витрату ферменту на вимірювання активності, але не завжди застосовні через тривалості розділення речовин у процесі хроматографії (та електрофорезу).
4. Експериментальна частина: Дослідження впливу температури (або рН) середовища на амілолітичну здатність ферментніх препаратів. (обсяг 3 стор.)
Зазначити умови проведення досліджень, результати досліджень, розрахунки амілолітичної активності, побудувати графік залежності амілолітичної активності від температури (чи рН) середовища, визначити оптимальну температуру (чи рН) та описати графік, вказавши як змінюється активність ферменту (на скільки % чи разів відбувається збільшення чи зменшення активності із зміною температури чи рН середовища до таки-то значень).
Лабораторна робота 9 НДРС.
Визначення амілолітичної здатності ферментних препаратів.
Амілази каталізують гідроліз високомолекулярних полісахаридів крохмалю і глікогену. Найважливішим джерелом амілаз є злакові, які містять їх як у непророщеному, так і пророщеному зерні. В останньому випадку амілази проявляють високу активність.
Широко застосовуються амілази у крохмалепатоковому, спиртовому, пивоварному і хлібопекарському виробництвах як головні ферменти, що каталізують процеси розщеплення крохмалю й утворення цукрів, що можуть зброджуватись.
Амілолітичну активність характеризує здатність ферментів каталізувати гідроліз крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом.
Метод характеризує активність α–амілази, але при наявності в препараті β–амілази і глюкоамілази цим методом визначають сумарну дію всіх амілолітичних ферментів.
За одиницю амілолітичної активності прийнято таку кількість ферменту, що каталізує розщеплення 1 г розчинного крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом, за 1 год при температурі 30 °С у чітко визначених умовах. Амілолітичну здатність (АЗ) препарату виражають числом указаних одиниць в 1 г сухого препарату чи в 1 мл розчину. При такому способі вираження АЗ безпосередньо показує скільки грамів крохмалю може бути прогідролізовано до нездатних забарвлюватись йодом декстринів 1 г препарату, культури чи 1 мл розчину за 1 год (в умовах, аналогічних умовам визначення).
Мета роботи: засвоїти методику визначення амілолітичної здатності ферментного препарату.
Завдання на виконання роботи: визначити амілолітичну здатність ферментного препарату за швидкістю гідролізу крохмалю до декстринів.
Апаратура: водяна баня; секундомір.
Лабораторний посуд: мірні колби; піпетки; пробірки; скляні палички.
Матеріали і реактиви: 1,0 %–й розчин розчинного картопляного крохмалю (наважку беруть з такого розрахунку, щоб в 100 мл розчину був 1 г сухого крохмалю, кількісно переводять її у велику склянку з киплячою водою, кип’ятять 2 хв й охолоджують, весь час перемішуючи розчин скляною паличкою. Охолоджений крохмаль переносять у мірну колбу того об’єму, із розрахунку на який взята наважка крохмалю, додають буферний розчин у кількості 10 мл на 100 мл розчину і доводять до позначки дистильованою водою. Розчин крохмалю готують у день аналізу); буферний розчин: змішують рівні об’єми нормальних розчинів оцтової кислоти (58 мл льодяної оцтової кислоти в 1 л дистильованої води) та натрій оцтовокислого (82 г CH3COONa або 136,1 г CH3COONa.3H2O в 1 л води), рН = 4,7; основнй розчин йоду (1,4 г кристалічного йоду і 4,4 г калій йодистого розчиняють у малому об’ємі води і доводять об’єм розчину до 100 мл, зберігають у темному місці); робочий розчин йоду готують в день аналізу (20 мл основного розчину йоду доводять дистильованою водою до 100 мл і на кожні 100 мл робочого розчину додають 4 г йодистого калію); розчин технічного амілосубтиліну (1:1000).
Принцип методу ґрунтується на гідролізі 1,0 %–го буферного розчину крохмалю під впливом амілолитичних ферментів. Кінець реакції контролюють візуально за йодною пробою. За часом, протягом якого проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, визначається амілолітична активність препарату.
Хід роботи. У конічну колбу місткістю 50 – 100 мл вносять піпеткою 20 мл 1,0 %–го розчину крохмалю і занурюють у водяну баню з температурою 30 °С (0,2 °С). Загальний об’єм реакційної суміші завжди має дорівнювати 30 мл, і якщо на аналіз беруть менше 10 мл ферментного розчину, то об’єм, якого не достає, доповнюють дистильованою водою, яку приливають перед додаванням ферментного розчину.
Через 10 хв витримування в бані у колбу вносять ферментний розчин при ретельному перемішуванні і точно за секундоміром відмічають час. За початок реакції беруть час, коли з піпетки виллється половина вмісту. Через кожну хвилину (або частіше) після початку реакції скляною паличкою відбирають краплину рідини і на білій порцеляновій пластинці з’єднують її з раніше нанесеною краплиною робочого розчину йоду.
Реакція розщеплення крохмалю вважається закінченою, коли йод перестане давати зміну забарвлення при з’єднанні з краплиною дослідної рідини (протягом перших 10 с).
Час, за який проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, може становити від 3 до 20 хв, але надійніші результати отримують у межах від 5 до 15 хв.
Примітка. Якщо час зникнення забарвлення менше 3 хв, то визначення повторюють з меншою кількістю розчину фермента, наприклад – 2 мл. У цьому разі в пробірку чи колбу з 20 мл крохмалю вносять 8 мл дистильованої води. Під час аналізу дуже активних препаратів концентрації розчинів роблять меншими (0,1 г в 200 або 500 мл).
Якщо час зникнення забарвлення становить більше 20 хв, то готують розчин більшої концентрації, наприклад 1:50 чи 1:100, а рідину можна не розбавляти зовсім.
У разі зникнення забарвлення в межах 3 – 5 хв проби відбирають кожні 15 с; 5 – 10 хв – кожні 30 с; а понад 10 хв – кожну хвилину.
Скляну паличку після кожної проби промивають дистильованою водою і витирають чистим некрохмаленим рушником.
Розрахунок АЗ проводять за формулою:
(5.3)де 0,2 – кількість крохмалю в реакційній суміші, г; 60 – коефіцієнт перерахунку на 1 год; а – кількість ферментного препарату, введеного в реакційну суміш, грами повітряно–сухої речовини або мілілітри рідинних об’єктів; t – час, за який пройшло розщеплення крохмалю до нездатних забарвлюватися йодом продуктів, хв; 1 – перерахунок на 1 г повітряно–сухого препарату або 1 мл розчину.
Приклад розрахунку. Для аналізу беруть 5 мл ферментного розчину при розбавленні 1:2000, що відповідає 0,0025 г препарату (1·5/2000)=0,0025 г). Забарвлення з йодом зникає через 6,5 хв, тоді за формулою АЗ=12/0,0025·6,5=740.
Аналізують одержані результати, складають висновки і рекомендації.
Дані:
0 градусів = 60хв до часу дії
20 = 7-10
37 = 3
60 = 35-40
Розрахунки:
АЗ = 12/0,01·60 = 12/0,6 = 20
АЗ = 12/0,01·8,5 = 12/0,085 = 141,17
АЗ = 12/0,01·3 = 12/0,03 = 400
АЗ = 12/0,01·37,5 = 12/0,375 = 32
5. Висновки
В цьому науковому звіті ми досліджували амілолітичні ферменти, а саме: загальну характеристику цих ферментів, вплив зовнішніх факторів, будову, властивості, одержання у промисловості, механізм дії.
У експериментальні частині ми дослідили вплив температури середовища на амілолітичну здатність ферментних препаратів.
Із розрахункових даних і графіка, ми можемо зрозуміти, що найвища амілолітична активність відбувається при 37,5 градусів та при 20 градусах.
І можемо зробити висновок, що температура впливає на амілолітичну активність.
6. Використана література:
https://studfile.net/preview/7397389/page:7/
http://chemanalytica.com/book/novyy_spravochnik_khimika_i_tekhnologa/06_syre_i_produkty_promyshlennosti_organicheskikh_i_neorganicheskikh_veshchestv_chast_II/5426
http://dspace.nbuv.gov.ua/bitstream/handle/123456789/3911/2008_2_39-51.pdf?sequence=1
https://books.ifmo.ru/file/pdf/2440.pdf
https://www.bestreferat.ru/referat-125039.html
1 2