додати матеріал


Центрифугування

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

Курсова робота

Центрифугування

1. Принцип методу

Поділ речовин за допомогою центрифугування засноване на різній поведінці часток у відцентровому полі. Суспензію частинок, вміщену в пробірку, завантажують в ротор, встановлений на валу приводу центрифуги.

У відцентровому полі частинки, що мають різну щільність, форму або розміри, осідають з різною швидкістю. Швидкість седиментації залежить від відцентрового прискорення, прямо пропорційного кутовий швидкості ротора і відстані між часткою і віссю обертання:

а відцентрове прискорення тоді буде дорівнює)

Оскільки один оборот ротора становить 2п радіан, кутову швидкість ротора в оборотах на хвилину можна записати так:

Відцентрове прискорення зазвичай виражається в одиницях g і називається відносне відцентрове прискорення, тобто


або

При перерахуванні умов поділу часток вказують швидкість обертання і радіус ротора, а також час центрифугування. , рассчитанных из среднего радиуса вращения столбика жидкости в центрифужной пробирке. Відцентрове прискорення звичайно виражають в одиницях g, розрахованих із середнього радіусу обертання стовпчика рідини в центріфужний пробірці. На підставі рівняння Доулем і Котціасом була складена номограма, що виражає залежність Оцу від швидкості обертання ротора і радіуса р.

Швидкість седиментації сферичних частинок залежить не тільки від відцентрового прискорення, але і від щільності і радіуса самих частинок і від в'язкості середовища суспендированием. Час, необхідний для осадження сферичної частинки в рідкому середовищі від меніска рідини до дна центріфужний пробірки, обернено пропорційно швидкості седиментації і визначається наступним рівнянням:

де t — вязкость среды, г ч радиус частицы, р ч плотность частицы, р — плотность среды, г м — расстояние от оси вращения до мениска жидкости, г д — расстояние от оси вращения до дна пробирки. - Час седиментації в секундах, rj - в'язкість середовища, м ч - радіус частинки, р год - щільність частинки, р - щільність середовища, г м - відстань від осі обертання до меніска рідини, м д - відстань від осі обертання до дна пробірки.

Як випливає з рівняння, при заданій швидкості обертання ротора час, необхідний для осадження гомогенних сферичних частинок, обернено пропорційно квадрату їх радіусів і різниці густин частинок і середовища і прямо пропорційно в'язкості середовища. Тому суміш гетерогенних, приблизно сферичних частинок, що розрізняються по щільності і розмірами, можна розділити або за рахунок різного часу осадження їх на дно пробірки при даному прискоренні, або за рахунок розподілу седіментірующіх частинок вздовж пробірки, що встановлюється через певний проміжок часу. При розділенні речовин необхідно враховувати і такі важливі фактори, як щільність і в'язкість середовища. Описаними методами можна розділяти клітинні органели з гомогенатов тканин. Основні компоненти клітини осідають в такій послідовності: спочатку цілі клітини та їх фрагменти, потім ядра, хлоропласти, мітохондрії, лізосоми, мікросоми і, нарешті, рибосоми. Осадження несферичних часток не підпорядковується рівнянню, тому частинки однакової маси, але різної форми осаджуються при різних швидкостях. Ця особливість використовується при дослідженні за допомогою ультрацентрифугування конформації макромолекул.

Препаративні центрифугування полягає у виділенні біологічного матеріалу для наступних біохімічних досліджень. При цьому можна брати великі кількості вихідного біологічного матеріалу, наприклад посіви мікробних клітин з періодичних або безперервних культур, а також посіви рослинних і тваринних клітин з культур тканини і плазми крові. За допомогою препаративного центрифугування виділяють велику кількість клітинних частинок для вивчення їхньої морфології, структури і біологічної активності. Метод застосовується також для виділення таких біологічних макромолекул, як ДНК і білки із заздалегідь очищених препаратів.

Аналітичне центрифугування застосовується головним чином для вивчення чистих або практично чистих препаратів макромолекул або частинок, наприклад рибосом. У даному випадку використовується невелика кількість матеріалу, а седиментація досліджуваних частинок безперервно реєструється за допомогою спеціальних оптичних систем. Метод дозволяє отримувати дані про чистоту, молекулярному вазі і структурі матеріалу. У практикумах для студентів препаративні центрифугування застосовується набагато частіше, ніж аналітичне, тому ми зупинимося на ньому більш докладно, хоча в основі обох методів лежать загальні принципи.

2. Препаративні центрифугування

2 .1 Диференціальне центрифугування

Цей метод заснований на відмінності в швидкостях седиментації частинок, що відрізняються один від одного розмірами і щільністю. Розділяється матеріал, наприклад гомогенат тканини, центрифугують при ступінчастому збільшенні відцентрового прискорення, яке вибирається так, щоб на кожному етапі на дно пробірки осаджувалася певна фракція. В кінці кожної стадії осад відокремлюють від надосадової рідини і кілька разів промивають, щоб у кінцевому підсумку отримати чистий осадову фракцію. На жаль, отримати абсолютно чистий осад практично неможливо; щоб зрозуміти, чому це відбувається, звернемося до розгляду процесу, що відбувається в центріфужний пробірці на початку кожної стадії центрифугування.

Спочатку всі частинки гомогенату розподілені за обсягом центріфужний пробірки рівномірно, тому отримати чисті препарати опадів самих важких частинок за один цикл центрифугування неможливо: перший утворився осад містить в основному найважчі частинки, але, крім цього, також деяку кількість всіх вихідних компонентів. Одержати досить чистий препарат важких частинок можна лише при повторному суспендированием і центрифугуванні вихідного осаду. Подальше центрифугування супернатанту при подальшому збільшенні відцентрового прискорення призводить до седиментації частинок середніх розмірів і щільності, а потім і до осадження найдрібніших частинок, що мають найменшу щільність. На рис. 2.3 зображена схема фракціонування гомогенату печінки щура.

Диференціальне центрифугування є, мабуть, найпоширенішим методом виділення клітинних органел з гомогенатов тканин. Найбільш успішно застосовується цей метод для розділення таких клітинних органел, які значно відрізняються один від одного за розмірами і щільності. Але навіть і в цьому випадку одержувані фракції ніколи не бувають абсолютно гомогенними, і для їх подальшого поділу застосовують інші методи, описані нижче. Ці методи, засновані на відмінностях у щільності органел, забезпечують більш ефективне розділення завдяки тому, що центрифугування здійснюють у розчинах з безперервним або ступінчастим градієнтом щільності. Недоліком цих методів є те, що доводиться витрачати час на отримання градієнта щільності розчину.

2.2 Зонально-швидкісний центрифугування

-зонального центрифугирования, заключается в наслаивании исследуемого образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности. Метод зонально-швидкісного, або, як його ще називають, s-зонального центрифугування, полягає в нашаровуванні досліджуваного зразка на поверхню розчину з безперервним градієнтом щільності. Потім зразок центрифугують до тих пір, поки частки не розподіляться уздовж градієнта у вигляді дискретних зон або смуг. Завдяки створенню градієнта щільності вдається уникнути змішування зон, що виникає в результаті конвекції. Метод зонально-швидкісного центрифугування застосовується для поділу гібридів РНК-ДНК, субодиниць рибосом та інших клітинних компонентів.

2.3 Ізопікніческое центрифугування

Ізопікніческое центрифугування проводять як у градієнті щільності, так і звичайним шляхом. Якщо центрифугування проводиться не в градієнті щільності, препарат спочатку центрифугують так, щоб осіли частинки, молекулярна вага яких більша, ніж у досліджуваних частинок. Ці важкі частки відкидають, і зразок суспендують у середовищі, щільність якої така сама, як і у фракції, яку хочуть виділити, а потім центрифугують до тих пір, поки досліджувані частки не осядуть на дно пробірки, а частки меншої щільності не спливуть на поверхню рідини ..

Інший спосіб полягає в нашаровуванні зразка на поверхню розчину з безперервним градієнтом щільності, що охоплює діапазон щільності всіх компонентів суміші. Центрифугування проводять до тих пір, поки плавуча щільність часток не зрівняється з щільністю відповідних зон, тобто поки не відбудеться поділ часток по зонах. Метод отримав назву зонально-ізопікніческого, або резонального центрифугування, тому що основним моментом тут є плавуча щільність, а не розміри чи форма частинок. На величину щільності, при якій частинки утворюють ізопікніческіе смуги, впливає природа середовища суспендированием; частинки можуть бути проникними для одних сполук, що знаходяться в розчині, і непроникними для інших або ж приєднувати молекули розчину. При використанні зонального ротора мітохондрії, лізосоми, пероксисоми і мікросоми концентруються в смугах з 42%, 47%, 47% і 27%-ної сахарозою, відповідних щільності 1,18, 1,21, 1,21 і 1,10 г-см -3 відповідно. Щільність субклітинних органел залежить також і від виборчого поглинання ними певних сполук. -1339 приводит ^увеличению размеров и уменьшению плотности лизосом печени; плотность митохондрий и пероксисом остается без изменений. Введення щурам не викликає гемоліз детергенту тритона WR -1339 призводить ^ збільшення розмірів і зменшення щільності лізосом печінки; щільність мітохондрій і пероксисом залишається без змін. Незважаючи на те що седиментаційні властивості лізосом при цьому, як правило, не змінюються, їх рівноважна щільність у градієнті сахарози знижується з 1,21 до 1,1, що призводить до відповідного поділу лізосомне-пероксісомальной фракції. Ця особливість використовується при кількісному поділі лізосом, мітохондрій і пероксисом, заснованому на видаленні з гомогенної середовища всіх часток з більшою, ніж у мікросом, щільністю і наступному ізопікніческом центрифугуванні що випали в осад важких частинок.

2.4 Рівноважний центрифугування в градієнті щільності

Для створення градієнта щільності використовують солі важких металів, наприклад рубідію або цезію, а також розчини сахарози. Зразок, наприклад, ДНК, змішують з концентрованим розчином хлористого цезію. І розчинена речовина, і розчинник спочатку розподіляються по всьому об'єму рівномірно. , так как ионы цезия обладают большой массой. У ході центрифугування встановлюється рівноважний розподіл концентрації, а отже, і щільності CsCl, так як іони цезію володіють великою масою. Під дією відцентрового прискорення молекули ДНК перерозподіляються, збираючись у вигляді окремої зони в частині пробірки з відповідною їм щільністю. . Равновесное центрифугирование в градиенте плотности является также одним из методов разделения и изучения липопротеидов плазмы крови человека. Метод застосовується головним чином в аналітичному центрифугуванні і був використаний Мезельсоном і Сталем для вивчення механізму реплікації ДНК Є. coli. Рівноважний центрифугування в градієнті щільності є також одним з методів розділення та вивчення ліпопротеїдів плазми крові людини.

2. 5 Формування і витяг градієнтів

2.5.1 Природа градієнтів

Для створення градієнтів щільності розчинів найчастіше застосовуються розчини сахарози, іноді з фіксованим рН. 2 0. У деяких випадках гарний поділ виходить при використанні замість звичайної води D 2 0. У табл. 2.1 наведено властивості деяких розчинів сахарози.

Вибір градієнта диктується конкретними завданнями фракціонування. Так, наприклад, фікол, що випускається фірмою Pharmacia Fine , может заменять сахарозу в тех случаях, когда необходимо создать градиенты с большой плотностью и низким осмотическим давлением. Chemicals, може замінювати сахарозу в тих випадках, коли необхідно створити градієнти з великою щільністю і низьким осмотичним тиском. Ще одна перевага фікола полягає в тому, що він не проходить через клітинні мембрани. такие градиенты используются только в роторах, изготовленных из стойких металлов, например титана» Для створення градієнтів більшої щільності застосовують солі важких металів, наприклад рубідію і цезію, однак через коррозирующего дії CsCl такі градієнти використовуються тільки в роторах, виготовлених із стійких металів, наприклад титану »

2.5.2 Методика створення ступеневої градієнта щільності

Для створення градієнта щільності в центрифужну пробірку обережно вносять за допомогою піпетки декілька розчинів з послідовно зменшується щільністю. Потім на самий верхній шар, що має найменшу щільність, нашаровують зразок у вигляді вузької зони, після чого пробірку центрифугують. Отримати плавні лінійні градієнти можна за рахунок згладжування східчастих градієнтів при тривалому стоянні розчину. Процес можна прискорити, обережно перемішуючи вміст пробірки дротом або злегка похитуючи пробірку.

2.5.3 Методика створення плавного градієнта щільності

У більшості випадків для створення плавного градієнта щільності користуються спеціальним пристроєм. Воно складається з двох циліндричних судин чітко визначеного однакового діаметра, сполучених один з одним у нижній частині за допомогою скляної трубки з контрольним клапаном, що дозволяє регулювати пропорції, у яких змішується вміст обох судин. Один з них забезпечений мішалкою і має вихідний отвір, через яке розчин стікає в центрифужні пробірки. Більш щільний розчин поміщають у змішувач; другий циліндр заповнюють розчином меншої щільності. Висота стовпчика розчинів в обох циліндрах встановлюється таким чином, щоб гідростатичний тиск у них було однаковим. Більш щільний розчин поступово випускається з змішувача в центрифужні пробірки і одночасно заміщається рівним об'ємом розчину меншої щільності, що надходить в змішувач з другого циліндра через контрольний клапан. Гомогенність розчину в змішувачі забезпечується за рахунок постійного перемішування розчину з допомогою мішалки. У міру зливання розчину в центрифужні пробірки щільність його зменшується і в пробірках створюється лінійний градієнт щільності. Нелінійні градієнти можна створювати за допомогою системи, що складається з двох циліндрів неоднакового діаметру.

Для формування градієнтів щільності різної крутизни користуються системою з двох механічно керованих шприців, які заповнюють розчинами неоднаковою щільності. Різні градієнти можна створювати, змінюючи відносну швидкість руху поршнів.

2.5.4 Витяг градієнтів з центріфужний пробірок

Після завершення центрифугування і поділу часток необхідно витягти утворилися зони. Це роблять кількома способами, найчастіше методом витіснення. Центрифужну пробірку проколюють біля основи і в нижню її частину повільно вводять дуже щільне середовище, наприклад 60-70%-ний розчин сахарози. Що знаходиться зверху розчин витісняється, і фракції відбирають за допомогою шприца, піпетки або спеціального пристосування, з'єднаного через трубочку з колектором фракцій. Якщо пробірки виготовлені з целулоїду або нітроцелюлози, фракції витягають, надрізавши пробірку спеціальним лезом. Для цього центрифужну пробірку, закріплену в штативі, надрізають безпосередньо під потрібної зоною і відсмоктують фракцію шприцом або піпеткою. При підходящої конструкції ріжучого пристрою втрата розчину буде мінімальною. Збір фракцій здійснюють також, проколів підставу пробірки тонкої порожнистої голкою. Краплі, що випливають з пробірки через голку, збирають у колектор фракцій для подальшого аналізу.

2.5.5 препаративні центрифуги та їх застосування

. Они отличаются друг от друга только емкостью и имеют ряд сменных роторов: угловых и с подвесными стаканами. Препаративні центрифуги можна підрозділити на три основні групи: центрифуги загального призначення, швидкісні центрифуги і препаративні ультрацентрифугу. Центрифуги загального призначення дають максимальну швидкість 6000 об • хв -1 і Оцу до 6000 g. Вони відрізняються один від одного лише розміром і мають ряд змінних роторів: кутових і з підвісними склянками. Однією з особливостей цього виду центрифуг є їх велика ємність - від 4 до 6 дм 3, що дозволяє завантажувати їх не тільки центріфужний пробірками на 10,50 і 100 см 3, але і судинами ємністю до 1,25 дм 3. У всіх центрифугах цього типу ротори жорстко кріпляться на валу приводу, і центрифужні пробірки разом з їх вмістом повинні бути ретельно врівноважені і різнитися за вагою не більше ніж на 0,25 м. Не можна завантажувати в ротор непарне число пробірок, а при неповному завантаженні ротора пробірки слід розміщувати симетрично, одна проти іншої, забезпечуючи таким чином рівномірний розподіл пробірок щодо осі обертання ротора.

. Швидкісні центрифуги дають граничну швидкість 25 000 об-хв -1 і Оцу до 89000 g. Камера ротора оснащена системою охолодження, що запобігає нагрівання, яке виникає внаслідок тертя при обертанні ротора. Як правило, швидкісні центрифуги мають ємність 1,5 дм 3 та забезпечені змінними роторами, як кутовими, так і з підвісними склянками.

. Они снабжены как холодильником, так и вакуумной установкой, чтобы предотвратить перегрев ротора вследствие трения его о воздух. Препаративні ультрацентрифугу дають граничну швидкість до 75000 об-хв -1 і максимальне відцентрове прискорення 510 000 g. Вони забезпечені як холодильником, так і вакуумною установкою, щоб запобігти перегріву ротора внаслідок тертя його об повітря. Ротори таких центрифуг виготовляють з високоміцних алюмінієвих або титанових сплавів. В основному застосовують ротори з алюмінієвих сплавів, проте в тих випадках, коли необхідні особливо високі швидкості, користуються роторами з титану. Для зменшення вібрації, що виникає в результаті порушення рівноваги ротора через нерівномірний наповнення центріфужний пробірок, ультрацентрифугу мають гнучкий вал. Центрифужні пробірки і їх вміст повинні бути ретельно врівноважені з точністю до 0,1 г. Аналогічні вимоги слід дотримуватися і при завантаженні роторів центрифуг загального призначення.

2.6 Конструкція роторів

2.6.1 Кутові ротори і ротори з підвісними склянками

Ротори препаративних центрифуг зазвичай бувають двох типів - кутові і з підвісними склянками. Кутовими вони називаються тому, що поміщаються в них центрифужні пробірки весь час перебувають під певним кутом до осі обертання. У роторах з підвісними склянками пробірки встановлюються вертикально, а при обертанні під дією виникаючої відцентрової сили переходять у горизонтальне положення; кут нахилу до осі обертання становить 90 °.

У кутових роторах відстань, яку проходить частками до відповідної стінки пробірки, досить невелика, і тому седиментація відбувається порівняно швидко. Після зіткнення зі стінками пробірки частки зісковзують вниз і утворюють на дні осад. При центрифугуванні виникають конвекційні потоки, які в значній мірі ускладнюють поділ часток з близькими седиментаційним властивостями. Тим не менш ротори подібної конструкції з успіхом застосовуються для поділу часток, швидкості седиментації яких різняться досить сильно.

У роторах з підвісними склянками також спостерігаються конвекційні явища, однак виражені вони не так сильно. Конвекція є результатом того, що під дією відцентрового прискорення частинки осідають в напрямку, не строго перпендикулярно осі обертання, і тому, як і в кутових роторах, вдаряються об стінки пробірки і зісковзують на дно.

Конвекційних явищ і ефектів завихрення вдається до деякої міри уникнути, використовуючи пробірки секторіально форми в роторах з підвісними склянками і регулюючи швидкість обертання ротора; перерахованих вище, недоліків позбавлений також метод центрифугування в градієнті щільності.

2.6.2 Ротори безперервної дії

Ротори безперервної дії призначені для швидкісного фракціонування відносно невеликих кількостей твердого матеріалу з суспензій великих обсягів, наприклад для виділення клітин з живильних середовищ. У ході центрифугування суспензія частинок додається в ротор безперервно; пропускна здатність ротора залежить від природи осаждаемого препарату і варіюєте межах від 100 см 3 до 1 дм 3 в 1 хв. Особливість ротора полягає в тому, що він представляє собою ізольовану камеру спеціальної конструкції; вміст її не сполучається з зовнішнім середовищем, а тому не забруднюється і не розпорошується.

2.6.3 Зональні ротори, або ротори Андерсона

Зональні ротори роблять з алюмінієвих або титанових сплавів, які здатні витримувати дуже значні відцентрові прискорення. Зазвичай в них є циліндрична порожнина, що закривається кришкою, що знімається. Всередині порожнини, на осі обертання розташована осьова трубка, на яку надівається насадка з лопатями, що розділяють порожнину ротора на чотири сектори. Лопаті або перегородки мають радіальні канали, по яких з осьової трубки до периферії ротора нагнітається градієнт. Завдяки такій конструкції лопатей конвекція зведена до мінімуму.

Заповнення ротора здійснюється при його обертанні зі швидкістю близько 3000 об / хв -1. У ротор нагнітають заздалегідь створений градієнт, починаючи із шару найменшої щільності, який рівномірно розподіляється по периферії ротора і утримується біля зовнішньої його стінки перпендикулярно осі обертання завдяки відцентровій силі. При наступному додаванні верств градієнта більшої щільності відбувається безперервне зміщення до центру менш щільних шарів. Після того як в ротор буде нагнітаючи весь градієнт, його заповнюють до повного обсягу розчином, званим «подушкою», щільність якого збігається або трохи перевищує найбільшу щільність преформованих градієнта.

Потім через осьову трубку, нашаровують досліджуваний зразок, який витісняють з трубки в обсяг ротора з допомогою розчину меншої щільності, при цьому з периферії видаляється такий же обсяг «подушки». Після всіх цих процедур швидкість обертання ротора доводять до робочої і протягом необхідного проміжку часу проводять або зонально-швидкісний, або зонально-ізопікніческое фракціонування. Витяг фракцій проводять при швидкості обертання ротора 3000 об - мін -1. Вміст ротора витісняють шляхом додавання з периферії «подушки», в першу чергу витісняються менш щільні шари. Завдяки особливій конструкції осьового каналу ротора Андерсона змішування зон при їх витіснення не відбувається. Вихід градієнт пропускають через пристрій, що реєструє, наприклад клітинку спектрофотометра, за допомогою якого з поглинання при 280 нм можна визначити вміст білка, або через спеціальний детектор радіоактивності, після чого збирають фракції.

Ємність зональних роторів, використовуваних при середніх швидкостях, варіює від 650 до 1600 см 3, що дозволяє одержувати досить велику кількість матеріалу. Зональні ротори застосовуються для видалення білкових домішок з різних препаратів і для виділення і очищення мітохондрій, лізосом, полісом і білків.

2.6.4 Аналіз субклітинних фракцій

Властивості отриманого при фракціонуванні препарату субклітинних частинок можна віднести до властивостей самих частинок тільки в тому випадку, якщо препарат не містить домішок. Отже, завжди необхідно оцінювати чистоту одержуваних препаратів. Ефективність гомогенізації і наявність у препараті домішок можна визначити за допомогою мікроскопічного дослідження. Однак відсутність видимих ​​домішок ще не є достовірним доказом чистоти препарату. Для кількісної оцінки чистоти отриманий препарат піддають хімічному аналізу, який дозволяє встановити вміст у ньому білків або ДНК, визначити його ферментативну активність, якщо можливо, і імунологічні властивості.

Аналіз розподілу ферментів під фракціоніруемих тканинах заснований на двох загальних засадах. Перший з них полягає в тому, що всі частки даної субклітинному популяції містять однаковий набір ферментів. Другий передбачає, що кожен фермент локалізований в якомусь певному місці всередині клітини. Якщо б це положення було вірно, то ферменти могли б виступати в ролі маркерів для відповідних органел: наприклад, цито-хромоксідаза і моноамінооксидазу служили б ферментами-маркерами мітохондрій, кислі гідролази - маркерами лізосом, каталаза - маркером пероксисом, а глюкозо-6-фосфатаза - маркером мембран мікросом. Виявилося, однак, що деякі ферменти, наприклад малатдегідрогеназа, Р-глюкуронідазу, НАДФ 'Н-цитохром-с-редуктаза, локалізовані більш ніж в одній фракції. Тому до вибору ферментів-маркерів субклітинних фракцій у кожному конкретному випадку слід підходити з великою обережністю. Більше того, відсутність ферменту-маркера ще не означає відсутності відповідних органел. Цілком імовірно, що при фракціонуванні відбувається втрата ферменту органелами або він пригнічується або інактивується; тому для кожної фракції зазвичай визначають не менше двох ферментів-маркерів.

Фракція

Обсяг, см '

Загальне розведення

Екснюк-ція, 660 нм

Одиниці активності ферменту

Вихід активності у фракції,%


121

1:35

0,45

515



30

1:21,7

0,195

35,2

6,99


21,5

1:105

0,3

186,3

37


16,5

1:105

0,34

162

32,17


21

1:27,7

0,41

51,5

10,23


287

1:21,7

0,04

68,5

13,61





503,5

100

2.7 Фракціонування методом диференціального центрифугування

2.7.1 Оформлення результатів

Результати, отримані при фракціонуванні тканин, зручніше за все оформляти у вигляді графіків. Так, при дослідженні розподілу ферментів в тканинах дані краще всього представляти у вигляді гістограм, що дають можливість візуально оцінити результати проведених експериментів.

Ферментативну активності вміст білка в пробі визначають як у вихідному гомогенаті, так і в кожної виділеної субклітинні фракції окремо. Сумарна ферментативна активність і вміст білка у фракціях не повинні сильно відрізнятися від відповідних значень у вихідному гомогенаті.

Потім проводять розрахунок ферментативної активності та вмісту білка в кожній фракції в% від загального виходу, на підставі чого становлять гістограму. По осі абсцис послідовно відкладають відносне колічество_ білка в кожній фракції в порядку їх виділення, а по осі ординат - відносну питому активність кожної фракції. Таким чином, за площею стовпчиків визначають ферментативну активність кожної фракції.

2.7.2 Аналітичне ультрацентрифугирование

На відміну від препаративного центрифугування, метою якого є поділ речовин та їх очищення, аналітичне ультрацентрифугирование застосовується в основному для вивчення седиментаційних властивостей біологічних макромолекул та інших структур. Тому в аналітичному центрифугуванні застосовують ротори та реєструючі системи особливої ​​конструкції: вони дозволяють безперервно спостерігати за седиментацією матеріалу у відцентровому полі.

. Ротор у них, как правило, имеет форму эллипсоида и соединен посредством струны с мотором, что позволяет варьировать скорость вращения ротора. Аналітичні ультрацентрифугу можуть розвивати швидкість до 70 000 об-хв -1, створюючи при цьому відцентрове прискорення до 500 000 g. Ротор у них, як правило, має форму еліпсоїда і з'єднаний за допомогою струни з мотором, що дозволяє варіювати швидкість обертання ротора. Обертається ротор у вакуумній камері, забезпеченою холодильним пристроєм, і має два відділення, аналітичну і балансуючу, які встановлюються в центрифузі суворо вертикально, паралельно осі обертання. Балансировочная осередок служить для врівноваження аналітичної і являє собою металевий блок з прецизійної системою. У ній є також два індексні отвори, що знаходяться на строго певній відстані від осі обертання, за допомогою яких визначають відповідні відстані в аналітичній осередку. Аналітична осередок, ємність якої, як правило, дорівнює 1 см 3, має секторальних форму. При правильній установці в роторі вона, незважаючи на те що стоїть вертикально, працює за тим же принципом, що і ротор з підвісними склянками, створюючи майже ідеальні умови седиментації. На торцях аналітичної комірки є віконця з кварцовими стеклами. Аналітичні ультрацентрифугу забезпечені оптичними системами, що дозволяють спостерігати за седиментацією частинок протягом усього періоду центрифугування. Через задані проміжки часу седіментірующій матеріал можна фотографувати. При фракціонуванні білків і ДНК за седиментацією спостерігають з поглинання в ультрафіолеті, а в тих випадках, коли досліджувані розчини мають різні коефіцієнти заломлення - за допомогою шлірен-системи або інтерференційної системи Релея. Два останніх методу засновані на тому, що при проходженні світла через прозорий розчин, що складається із зон з різною щільністю, на кордоні зон відбувається заломлення світла. При седиментації між зонами з важкими і легкими частинками утворюється межа, яка діє як заломлююча лінза, при цьому на фотопластинці, що використовується в якості детектора, з'являється пік. У ході седиментації відбувається переміщення кордону, а отже, і піку, за швидкістю пересування якого можна судити про швидкість седиментації матеріалу. Інтерферометричні системи відрізняються більшою чутливістю, ніж шлірен-системи. Аналітичні осередки бувають односекторною, які застосовуються найчастіше, і двухсекторной, які використовуються для порівняльного вивчення розчинника і розчиненої речовини.

У біології аналітичне ультрацентрифугирование застосовується для визначення молекулярних ваг макромолекул, перевірки чистоти одержуваних зразків, а також для дослідження конформаційних змін в макромолекулах.

2.8 Застосування аналітичного ультрацентрифугування

2.8.1 Визначення молекулярних ваг

Існує три основні методи визначення молекулярних ваг за допомогою аналітичного ультрацентрифугирования: визначення швидкості седиментації, метод седіментаціоіного рівноваги і метод наближення до седиментаційної рівноваги.

Визначення молекулярної ваги за швидкістю седиментації - це найбільш поширений метод. Центрифугування проводять при великих швидкостях, так що частинки, спочатку рівномірно розподілені по всьому об'єму, починають впорядкування переміщатися по радіусу від центру обертання. Між областю розчинника, вже вільною від частинок, і тією його частиною, що їх містить, утворюється чітка межа розділу. Ця межа при центрифугуванні переміщається, що дає можливість визначати швидкість седиментації частинок за допомогою одного з вищезазначених методів, реєструючи це переміщення на фотопластинці.

Швидкість седиментації визначається наступним співвідношенням:

де х - відстань від осі обертання в см,

t - Час у с,

— угловая скорость в рад-с -1 , w - кутова швидкість в рад-с -1,

s - Коефіцієнт седиментації "молекули.

Коефіцієнт седиментації - це швидкість, віднесена до одиниці прискорення, його вимірюють в одиницях Сеедберга; 1 одиниця Сведберга дорівнює 10 _13 с. зависит от молекулярного веса и формы частиц и является величиной, характерной для данной молекулы или надмолекулярной структуры. Чисельне значення s залежить від молекулярної ваги і форми частинок і є величиною, характерною для даної молекули або надмолекулярної структури. ; катал аза имеет коэффициент седиментации 11.35 S , субъединицы рибосом бактерий — от 30 до 50 S , а субъединицы рибосом эукариотов — от 40 до 60S. Наприклад, коефіцієнт седиментації лізоциму дорівнює 2,15 S; катав аза має коефіцієнт седиментації 11.35 S, субодиниці рибосом бактерій - від 30 до 50 S, а субодиниці рибосом еукаріотів - від 40 до 60S.

де М - молекулярна вага молекули, R — коэффициент седиментации молекулы, D - Газова стала, Т - абсолютна температура, s - коефіцієнт седиментації молекули, D - Коефіцієнт дифузії молекули, v - Парціальний питомий об'єм, який можна розглядати як обсяг, займаний одним грамом розчиненої речовини, р - щільність розчинника.

Метод седіментаціоіного рівноваги. Визначення молекулярних ваг цим методом проводиться при порівняно невеликих швидкостях обертання ротора, близько 7 000-8 000 об-хв -1, щоб молекули з великою молекулярною вагою не осідали на дно. Ультрацентрифугування проводять аж до досягнення частками рівноваги, що встановлюється під дією відцентрових сил, з одного боку, і дифузійних - з іншого, тобто до тих пір, поки частки не перестануть переміщатися. Потім по утворився градієнту концентрації розраховують молекулярна вага речовини 'згідно з формулою

де R - Газова стала, Т - абсолютна температура, ю - кутова швидкість, р - щільність розчинника, v - Парціальний питомий об'єм, з х і з 2 - концентрація розчиненої речовини на відстанях р р і г 2 від осі обертання.

Недоліком даного методу є те, що для досягнення седіментаціоіного рівноваги необхідно тривалий час - від декількох днів до декількох тижнів при безперервній роботі центрифуги.

Метод наближення до седиментаційної рівноваги був розроблений для того, щоб позбутися від недоліків попереднього методу, пов'язаних з великими витратами часу, необхідного для 'встановлення рівноваги. За допомогою цього методу можна визначати молекулярні ваги, коли центріфугіруемий розчин знаходиться в стані наближення до рівноваги. Спочатку макромолекули розподіляються по всьому об'єму аналітичної осередку рівномірно; потім у міру центрифугування молекули осідають, і щільність розчину в області меніска поступово зменшується. Зміна щільності ретельно реєструють, а потім шляхом складних розрахунків, що включають велике число змінних, визначають молекулярна вага даного з'єднання за формулами:

де R парциальный удельный объем, р — плотность растворителя, dcldr - Газова стала, Т - абсолютна температура, v - парціальний питомий об'єм, р - щільність розчинника, dcldr - Градієнт концентрації макромолекули, г м і г д - відстань до меніска і дна пробірки відповідно, з м і з д - концентрація макромолекул у меніска і у дна пробірки відповідно, М м —величины молекулярных весов, определенные по распределению концентрации вещества у мениска и дна пробирки соответственно. і M R-величини молекулярних ваг, певні з розподілу концентрації речовини у меніска і дна пробірки відповідно.

2.8.2 Оцінка чистоти препаратів

Аналітичне ультрацентрифугирование широко застосовується для оцінки чистоти препаратів ДНК, вірусів і білків. Чистота препаратів безсумнівно дуже важлива в тих випадках, коли потрібно точно визначити молекулярну вагу молекули. У більшості випадків про гомогенності препарату можна судити за характером кордону седиментації, використовуючи метод визначення швидкості седиментації: гомогенний препарат зазвичай дає одну різко обкреслені кордон. Присутні в препараті домішки проявляються у вигляді додаткового піку або плеча; вони ж зумовлюють асиметрію основного піку.

2.8.3 Дослідження конформаційних змін в макромолекулах

Ще одна область застосування аналітичного ультрацентрифугирования - дослідження конформаційних змін макромолекул. Молекула ДНК, наприклад, може бути одно-або дволанцюжкової, лінійною або кільцевою. Під дією різних сполук або при підвищених температурах ДНК зазнає ряд оборотних і необоротних конформаційних змін, які можна встановити по зміні швидкості седиментації зразка. Чим компактніше молекула, тим менше її коефіцієнт тертя в розчині і навпаки: чим менше вона компактна, тим більше коефіцієнт тертя і, отже, тим повільніше буде вона осаджують. Таким чином, розходження у швидкості седиментації зразка до і після різних впливів на нього дозволяють виявляти конформаційні зміни, що відбуваються в макромолекулах.

У аллостеріческій білків, таких, наприклад, як аспартат-транскарбамоілаза, конформаційні зміни виникають в результаті зв'язування їх з субстратом і малими лігандами. Дисоціацію білка на субодиниці можна викликати, обробивши його такими речовинами, як сечовина або парахлормеркурібензоат. Всі ці зміни легко можна простежити за допомогою аналітичного ультрацентрифугування.

Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Курсова
116.4кб. | скачати

© Усі права захищені
написати до нас
Рейтинг@Mail.ru