Хроматографічні методи

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.


Нажми чтобы узнать.
скачати

Введення

Хроматографічний метод - фізико-хімічний метод розділення компонентів складних сумішей газів, парів, рідин або розчинених речовин, заснований на використанні сорбційних процесів в динамічних умовах.

Звернення-ФАЗОВИХ ХРОМАТОГРАФІЯ (ОФХ, RP)

Сорбенти
Хімічно щеплені вперше були застосовані в колоночной рідинної хроматографії для одержання гідрофобних розподільних систем. Оскільки в таких системах відбувається «звернення» властивостей фаз, тобто нерухома фаза ставати неполярної, а рухлива - полярної, то вони отримали назву обернено-фазових систем.
Отримують ОФ модифікуванням поверхневих силанольних груп алкілхлорсіланамі. Здійснити модифікування всіх поверхневих силанольних груп не представляється можливим (50%). Замість монохлорсіланов застосовують діхлорсілани, однак, тоді не всі хлорні групи можуть прореагувати. Щоб поліпшити ступінь модифікуванні колонки і позбутися від хлор груп колонку обробляють сильним сіланізірующім агентом - тріметілхлорсіланом. При такій обробці вдається підвищити степінь модифікації силікагелю до 90%. Відтворюваність величини ступеня покриття поверхні залишається гарної до тих пір, поки використовується одна і та ж партія силікагелю. Тому ОФ колонки відрізняються від партії до партії і від виробника до виробника.
Вплив щеплених алкільних груп відображає термін «гідрофобна селективність». У першому наближенні коефіцієнт ємності для даного розділяється з'єднання збільшується зі збільшенням зв'язаного вуглецю на одиницю обсягу колонки. Максимальне утримання забезпечує прищеплена октадецільная група. Такі нерухомі фази кращі, якщо розчинність поділюваних речовин у водному елюент обмежена. С18 характеризується також високою селективністю при поділі сусідніх членів гомологічних рядів. У той же час для поділу сполук, молекули яких мають великий розмір, високу гідрофобність і обмежену розчинність в елюент з високим вмістом органічних добавок, рекомендується фаза з короткими прищепленими ланцюгами.
Розчинники.
Елюотропний ряд звертається, найбільш часто використовуються розчинники ацетонітрил, метанол, тетрагідрофуран, вода.
Коефіцієнт ємності збільшується зі збільшенням вмісту води в елюент. Вибір розчинника визначається розчинністю в ньому речовини. З збільшення вмісту органічного компонента на 10% До зменшується в три рази.
Змінити відносне утримування при елюювання водно-метанольних розчинами можна, додаючи в елюент другий органічний компонент, наприклад ТГФ. На зверненої фазі сорбується неполярний компонент елюенту і властивості одержуваної фази відрізняються від вихідної.
Якщо з'єднання дисоціює на іони, то у піків на хроматограмі утворюються утворюються хвости. Тому для кращої форми піку при аналізі кислотних сполук у елюент додають не більше 1% кислоти, а для основних сполук - триетиламі або солі.
Вплив структури на утримання.
У першому наближенні можна прийняти, що утримування зростає зі зменшенням розчинності сполуки у воді, тобто зі зменшенням полярності. У гомологічних рядах додаток кожної метиленової групи збільшує час утримування. Розгалужені раніше виходять, ніж лінійні. Насишщенние раніше, ніж ненасичені
Порівняємо адсорбційну та ОФ хроматографії.
Рівновага у ОФ встановлюється швидше, тому більш прийнятні умови для проведення градієнтного елюювання.
Можливість застосування водних елюентов і аналізувати речовини, расворенние у воді.
Термін служби колонок з прищепленими фазами набагато більше, ніж у сілікагельних колонок.
Різноманіття модифікуючих реагентів в порівнянні з адсорбційної хроматографією.
Вторинні рівноваги на оберненій фазі.
Для розділення диссоциирующих сполук, крім цього молекула повинна бути не дуже великий (наприклад як амінокислоти, алкалоїди і т.д.), а з'єднання, обраний як протівоіона повинно володіти довгою насиченою алкільного ланцюгом (від чотирьох до десяти атомів вуглецю у ланцюжки)
В основу іон-парної хроматографії покладено принципи класичної екстнракціі з водної в органічну фазу іонних речовин у вигляді іон-парних сполук. У водних елюента протівоіони і іони поділюваних сполук утворюють диссоциирующие іонні пари (у рухомій фазі), які селективно утримуються на нерухомій фазі і в результаті розділяються. Якщо протівоіони адсорбуються на нерухомій фазі, іони поділюваних сполук взаємодіють з ними, утримуються і відповідно поділяються. Наприклад, з'єднання, що має кислотну групу, буде сорбироваться у вигляді іонної пари з тетрабутіламмоніевим іоном на сорбенті. У результаті стане можливим збільшити утримування аналізованого з'єднання.
Склад рухомої фази, тип протівоіона, рН, іонна сила елюента - варіювання цих параметрів дозволяє проводити оптимізацію умов поділу.

ГЕЛЬ-ПРОНІКАЮЩІЯ ХРОМАТОГРАФІЯ

ЦПХ має у своїй основі єдиний механізм поділу. У відсутності спец взаємодій проби і нерухомої фази порядок елюювання у всіх випадках є функцією розміру молекул. Для синтетичних нерозгалужених полімерів, що існують у розчині у вигляді статистичного клубка, розміри молекул можна безпосередньо пов'язати з молекулярної масою. Це дозволяє відкалібрувати колонку за допомогою полістирольних стандартів, елюіруя їх діхлорметаном, а потім проводити на цій колонці поділ білків або водорозчинних полімерів, елюіруя їх водою або водними буферними розчинами.
Мертвий об'єм у ЦПХ визначається як обсяг елюювання молекул низькомолекулярного речовини, не взаємодіє з сорбентаом, але проникаючому в усі пори, включаючи пори найменшого діаметра. Мертвий об'єм складається з обсягу нерухомої фази і об'єму пор. Обсяг нерухомої фази визначається як утримуваний об'єм повністю виключених молекул з великою середньою молекулярною масою не проникають в пори.
Сорбенти.
Стійкість до хімічних взаємодій, температурі і механічних впливів.
Широкі можливості варіювання проникності.
Однорідна структура.
Не повинні вступати в адсорбційні взаємодії.
Сефадекса. Поліакриламідні гелі, агарозного гелі, полістироли, силікатні сорбенти.
Розчинники.
Повинні розчиняти зразок
Змочувати сорбент
недопускати адсорбції полімеру на сорбенті.
ТГФ - універсальний розчинник,
Толуол - поліізопрен, силікони,
ДМФА - поліаміди,
Водні буферні розчини - білки.
Оптимізація умов поділу.
Визначити ММР для колонки по стандартному набору полістерола і вибрати відповідну колонку або кілька колонок. Виключити іонні взаємодії зразка шляхом введення нейтральних солей у елюент.

Іонообмінної хроматографії

Іоніти представляють собою нерозчинні ВМС, що містять здатні до іонізації функціональні групи і дають з іонами протилежного заряду нерозчинні солі. Вже давно відомі неорганічні іоніти, для пом'якшення води, і тільки з появою синтетичних органічних іонітів процеси іонного обміну стали широко використовуватися.
Залежно від характеру іонізуючих груп іоніти підрозділяють на катіоніти і аніоніти. Катіоніти є полівалентними нерозчинними кислотами, що утворюють нерозчинні солі з катіонами або обмінювати один катіон на інший. Аніонтіти являють собою органічні полівалентні підстави, що зв'язують аніони.
Катіоніт-SO3H + + NH4 + - Катіоніт-SO3NH4 + + H +
Катіоніт-SO3NH4 + + Na + - Катіоніт-SO3Na + + NH4 +
Аніоніт - NH +3 OH - + CH3COO - Аніоніт - NH +3 CH3COO - + OH-
Аніоніт - NH +3 CH3COO - + H + CL - Аніоніт - NH +3 CL - + CH3COO-H +
Як іонізуючих груп катіоніти можуть мати ароматичні сульфогрупи, фосфатні, карбоксильні групи або ароматичний гідроксил. Якщо в іоніте присутні іонізуючі групи кількох типів (поліфункціональні), то це не завжди сприятливо позначається на процесі поділу. Найбільш часто застосовуються монофункціональні іоніти. Здатність іоніти зв'язувати іони з протилежним знаком залежить від числа іонізуючих груп. Ємність іонітів звичайно виражають у вигляді числа мілліеквівалентов на 1гр сухого або на 1гр вологого іоніту.
Cтепень зшивання є однією з важливих характеристик іонітів. При збільшенні ступеня зшивання іоніти іони в нього проникають важче, рівновага встановлюється повільніше, вибірковість підвищується, а сопсобность пов'язувати великі іони зменшується. Швидкість встановлення рівноваги при хроматографії на іоніте в значній мірі залежить від розмірів часток. Рівновага встановлюється швидше в разі відносно невеликих частинок, але разом з тим на них сильніше виявляється небажана адсорбція, яка змінює форму зон поділюваних речовин.
Ступінь зв'язування різних іонів іонітами у водних розчинах можна оцінити за допомогою наступного правила. У разі катіонітів спорідненість зростає із збільшенням валентності іона або при даній валентності з підвищенням його атомного (молекулярного) ваги. У разі аніонітів спорідненість прямо пропорційно силі або основності кислот.
Як елюентом використовуються буферні розчини, а щоб виключити небажані гідрофобні взаємодії в елюент додають метанол або ацетонітрил (не більше 5%).
Оптимізація умов поділу.
Зміна рН.
Підвищення іонної сили.
Зміна температури.
Зміна складу буферного розчину.

Розподільної хроматографії

При розподільної хроматографії поділ здійснюється головним чином за рахунок коефіцієнтів розподілу поділюваних речовин. Відповідно до закону Нернста, для певної речовини і певної системи фаз коефіцієнт розподілу є величина стала, котра від концентрації речовини. Однак, відтворюваність розподільної хроматографії сильно залежить від концентрації розчиненого речовини. При низьких концентраціях цією обставиною можна знехтувати, але при більш високих концентраціях закон Нернста не дотримується (див. теорія екстракції + Кейл стр.443-452).
Для отримання розподільних систем з полярними твердими фазами (наприклад, силікагель) рекомендуються потрійні суміші розчинників, що складаються з неполярного елюента (наприклад, гептан, дихлорметан), сільнополярного компонента (звичайно води) і низькомолекулярного спирту або іншого розчинника, що змішується і з водою, і з неполярних компонентом. При підборі системи розчинників рідку фазу можна видалити промиванням колонки, наприклад, діхлорметаном. Після цього колонка придатна для нанесення нової нерухомої фази.
Для досягнення оптимального розділення необхідно, щоб колективні речовини краще розчинялися в нерухомій фазі. Речовини з коефіцієнтом розподілу, близьким до одиниці, при розподільній вимиваються з фронтом рухомої фази. Гідрофільні речовини краще поділяються при використанні гідрофільних сорбентів (силікагель, крохмаль, целюлоза), а для поділу гідрофобних речовин можна скористатися сорбентами для ОФ хроматографії.

Адсорбційна хроматографія

Макромолекули БАС відрізняються всередині своїх індивідуальних груп за фізико-хімічними властивостями незначно. Одним з найбільш характерних властивостей БАС є здатність оборотно пов'язувати інші речовини, звані в загальному випадку лігандами або афінним лігандами (аффінатамі). Наприклад, фермент - інгібітор, антиген - антитіло. Саме ця здатність служить основою для афінної хроматографії.
Вибір афінних лігандів здійснюється на підставі їх біологічної природи та біологічних властивостей поділюваних сполук. Склад елюента підбирається таким чином, щоб утворюється комплекс, наприклад фермент - інгібітор, на першому етапі елюювання не руйнувався, а баластні речовини легко елюіровалісь. Потім, склад елюента змінюють таким чином, щоб зруйнувати утворився комплекс. Склад елюетна, рН іонна сила також залежать від біологічної природи виділяється з'єднання.
Вимоги до носіїв.
Стеричних доступність.
Освіта комплексу БАС з лігандом, який ковалентно зв'язаний з матрицею вимагає достатнього простору. Тому одне з Вижній властивостей носіїв - висока пористість. Однак, пористість не грає ролі при хроматографії полісом, рибосом, інтактних клітин. У цьому випадку всі взаємодії відбуваються з поверхневими групами сорбенту.
Конформація приєднаного ліганду.
Висока реакційна здатність специфічних субстратів обумовлена ​​найбільш сприятливою конфігурацією груп субстрату. Тому способи прив'язки ліганда обмежені, тому що ліганд повинен бути прив'язаний тією частиною молекули, яка не бере участі у зв'язуванні.
Концентрація БАС, час врівноваження, швидкість потоку.
Наносити слід розбавлені розчини БАС, тому що якось пов'язано з дифузією в пори, стерично утрудненим. Процес афінної хроматографії - процес повільний, тому що необхідно якийсь час для утворення комплексу. Тому зменшення числа теоретичних тарілок призводить до збільшення ефективності. Іноді потік елюента зупиняють на кілька годин і тільки потім починають специфічне елюювання.
Неспецифічні впливу.
Неспецифічна сорбція баластних речовин можлива внаслідок іонного обміну або гідрофобних взаємодій.
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Хімія | Реферат
26кб. | скачати


Схожі роботи:
Методи попередніх еквівалентних перетворень та ітераційні методи з мінімізацією нев`язки
Методи прояви системної ідеї Евристичні методи дослідження систем управління
Грошові потоки та методи їх оцінки Методи оцінки фінансових активів
Методи дозиметрії
Методи навчання
Методи відсікання
Методи етнології
Градієнтні методи
Методи дослідження
© Усі права захищені
написати до нас
Рейтинг@Mail.ru