приховати рекламу

Хламідіоз Методи определеніядіагностікі

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.


Нажми чтобы узнать.
скачати

Хламідіоз - СУЧАСНІ ПІДХОДИ ДО ДІАГНОСТИКИ ТА ЛІКУВАННЯ

Цітоскопіческіе методи виявлення хламідій

При цітоскопіческом методі одночасно з пошуком цитоплазматичних клітин-включень Провачека враховується кількість лейкоцитів як показника запалення, а також додаткова інформація про наявність супутньої бактеріальної мікрофлори, дріжджоподібних грибів, трихомонад і т.п.

Показання: Гостра фаза захворювання.

Матеріалом для дослідження служать зіскрібки з уретри у чоловіків і уретри і / або цервікального каналу у жінок. Матеріал беруть спеціальними щіточками або ложечками Фолькмана. Виділення з цервікального каналу видаляються ватним тампоном. Щіточка вводиться в канал на 1-2 см, обертається 15 секунд. Соскобний матеріал розподіляється на предметному склі, висушується на повітрі і фіксується в метанолі або холодному ацетоні. Найбільш популярна забарвлення за Романовським-Гімзою. Після фарбування препарати проглядаються в світловому мікроскопі, використовуючи Імерсійний об'єктив (х90). При цьому цитоплазма клітин забарвлюється в блакитний колір, ядра в фіолетово-синій, цитоплазматичні включення визначаються у вигляді темно-синіх або рожевих мікроколоній на тлі блакитний цитоплазми. На стадії елементарних включення хламідій забарвлюються в рожевий колір, на стадії елементарних тілець-у синій.

Цітоскопіческій метод широко доступний, але ефективний лише при гострих формах інфекції, значно менш ефективний і інформативний при хронічних формах захворювання При урогенітальному хламідіозі частота виявлення тілець Провачека в зіскрібків уретри і цервікального каналу не перевищує 10-12%. Наявність цих тілець підтверджує діагноз хламідіозу, проте їх відсутність не виключає наявність інфекції.



Пряма імунофлюоресценція (ПІФ)

Цей метод передбачає пряме виявлення антигенів хламідій. При люмінесцентної мікроскопії включення хламідій визначаються у вигляді зеленої або жовто-зеленої флуоресценції включень на коричнево-помаранчевому тлі цитоплазми клітин Включення можуть мати зернисту гомогенну або змішану структуру.

Показаннями для діагностики хламідійної інфекції цим методом є:

1.Острий фаза захворювання.

2.Хроніческая фаза захворювання

3 Встановлення етіології хронічного інфекційного процесу урогенітального тракту

4. Вагітність з обтяженим акушерським анамнезом

5. Безпліддя неясного генезу.

Діагностична інформативність ПІФ пов'язана з тим, що з її допомогою виявляються не тільки корпускулярні, але і розчинні антигени хламідій Цей метод не залежить від можливої ​​зміни тинкторіальних властивостей мікроорганізму в процесі захворювання та лікування. ПІФ-метод є найважливішим скринінгове методом діагностики урогенітального хламідіозу. Його чутливість та специфічність при використанні моноклональних антитіл становить відповідно 65-90% і 85-90%. При оцінці результатів слід враховувати, що тільки показники внутрішньоклітинної флюоресценції можуть оцінюватися як позитивного результату цього тесту при використанні поліклональних антихламідійний антитіл, при використанні моноклональних - результат вважають за наявності 10 ЕТ в полі зору. Соскобние препарати готують також, як і для цітоскопіческіх досліджень.

Випускають діагностичні набори, що містять моноклональні антитіла для ПІФ, такі фірми: Syva, Drfco, Kallastad, Bartrels, Boots celltech, California Integrated Diagnostics, Orion Diagnostica. Реагенти фірм Syva, Difco, Kallastad представляють собою мічені ФІТЦ моноклональні антитіла до основного білка зовнішньої мембрани хламідій, а реагенти інших фірм - моноклональні антитіла до родоспеціфіческому хламидийном ліполісахаріду (ЛПС). У Росії ЗАТ "Ниармедик плюс" при НІІЕМ ім. Н.Ф. Гамалії РАМН випускає моноклональні антитіла до ЛПС хламідій, які успішно конкурують з продукцією іноземних фірм за якістю продукції. Це набір "Хламоноскрін" для визначення моноклональних антитіл до родоспеціфіческому ліпополісахарідной антигену і набір "Хламоноскрін-2" для визначення моноклональних антитіл до видоспецифической білкового антигену хламідій трахоматіс. Набори мають ФС 42-359598 і реєстраційне посвідчення МОЗ Росії 93 / 270 / 9.

Моноклональні антитіла відрізняються один від одного по викликається яскравості світіння, постійності виявляються форм ЕТ і ступеня специфічності. Для діагностики хламідій цим методом необхідний люмінесцентний мікроскоп.

У цілому, метод ПІФ відповідає критеріям високої чутливості і специфічності, але вимагає виконання досвідченим, компетентним лабораторним працівником.

Висококваліфікована експертна оцінка методом ПІФ рідко буває доступною, тому середня чутливість його знижується. Метод недостатньо чутливий і для стабільного визначення малих кількостей ЕТ. До того ж неможливо перевірити й негативні результати, і, отже, виявити серед них помилково негативні, що призводить до зниження чутливості.



Імуноморфологічні методи

Ці методи засновані на виявленні антигенних субстанцій хламідій в епітелії та інших тканинах шляхом обробки препаратів специфічними антитілами. Антитіла діагностичної антихламідійний сироватки з'єднані з якою-небудь міткою - люминесцирующей (ФІТЦ-антитіла) або ферментної (ензим-мічені антитіла).



Непрямий метод іммунофлюресценцііі

Непрямий метод іммунофлюресценціі застосовують у тих випадках, коли немає в наявності ФІТЦ-кон'югату антихламідійний антитіл. У цих випадках приготований тим же методом, що і для ПІФ препарат з клінічних проб обробляють спочатку антихламідійний антитілами, отриманими шляхом імунізації хламідіями овець, кролів, мишей чи інших тварин, а потім другий сироваткою, специфічною для виду тварини, яке було імунізовано хламідіями. Антитіла друге сироватки кон'югованих з ФІТЦ. Показання до застосування і специфічність даного методу збігаються з ПІФ.



Методи імуноферментного аналізу

Ці методи засновані на виявленні розчинної антигену хламідій в досліджуваних пробах. Найчастіше використовуються набори реактивів Imx Select Хламідія (Abbott Laboratories) і Chlamydia-antigen Elisa (Medac Diagnostica).

Тест Imx Select Хламідія заснований на технології ІФА-аналізу на мікрочастинках (МІФУ) і призначений для якісного визначення ліполісахарідного антигену С. trachomatis у ендоцервікальних і уретральних мазках на аналізаторі Imx. Даний набір містить компоненти, отримані з людського матеріалу, що обумовлює дотримання при роботі правил біологічної безпеки.

Вузол пробовідбірник / електрод додає мікрочастинки в лунку, що містить зразок. Попередньо екстрагований ліполісахарідний антиген (ЛПС) зразка зв'язується з мікрочастинками. Аліквотах реакційної суміші, яка містить комплекси мікрочастинок з ЛПС-антигеном, переноситься на скловолокнистий матрикс реакційної осередки. Мікрочастинки необоротно зв'язуються з матриксом. До матриксу додаються кролячі антитіла проти хламідій. Вони зв'язуються з ЛПС антигеном. Біотінілірованние козячі анти-кролячі антитіла додаються до матриксу і зв'язуються з комплексом анті-хламідія/ЛПС антиген. До матриксу додається кон'югат лужної фосфатази і антитіл проти біотину. Відбувається зв'язування кон'югату з комплексом антиген / антитіло. Після видалення не зв'язаний матеріал промиванням до матриксу додається субстрат 4-метілумбелліферілфосфат. Освіта флуоресціюючого продукту вимірюється в оптичному вузлі МІФУ.

Тест-система Chlamydia-Antigen-ELISA medac (реєстраційне посвідчення МОЗ РФ 97/128 від 07.02.97 р.) є економним і в той же час досить специфічним і чутливим методом в рутинній діагностиці хламідійної інфекції. Цей тест є метод твердофазного ІФА-аналізу для визначення антигенів хламідій. Тверда фаза покрита хламідійними моноклональними антитілами встановленої специфічності. Ампліфікація досягається з використанням технології полімерної кон'югації, у результаті чого відбувається фіксація, при якій на кожний пов'язаний ділянку антигену доводиться полімерний комплекс з високомолекулярним фрагментом. Крім того, ампліфікація виконується на стадії означеного відтворення з використанням запатентованої технології фермент-ампліфікації. Візуально позитивні проби забарвлюються в жовто-оранжевий колір. Інтенсивність забарвлення пропорційна кількості антигену хламідій. Точний результат дослідження визначають за допомогою мікроЕОМ, спектрофотометра "Мультіскан" або іншого апарата для ІФА при довжині хвилі 492 нм. Зразки дають значення поглинання вище або рівні значенням відсікаючого поглинання (cut-off), вважаються позитивними для хламідій. Чутливість і специфічність ІФ методів відповідно складає 65-70% і 90-100%. Показання до застосування такі ж, як і для методу прямий іммунофлюресценціі. Виявлення в сироватці крові антитіл до ліпополісахарідной антигену хламідій класів Ig G, Ig A, Ig M з визначенням їх титру дозволяє визначити стадію захворювання, обгрунтувати необхідність антибактеріального лікування й оцінити його ефективність.

Показання до виявлення антихламідійний антитіл класів Ig G, Ig А, Ig M в сироватці крові методом ІФА

1. Визначення стадії захворювання;

-Гостра, первинна;

-Хронічна;

-Реактивація або реінфекція;

-Стан після реконвалесценції (залишкова серологія).

2.Оцінка ефективності проведеного лікування (поряд з дослідженням методами ПЛР, культурального посіву).

3.Установление хламідійної етіології екстрагенітальних поразок (артрити, пневмонії, захворювання очей).

Порівнюючи різні діагностичні набори, ми рекомендуємо використовувати тест-систему r-Elisa фірми MEDAC DIAGNOSTICA (Німеччина). Реєстраційне посвідчення МОЗ РФ 97 від 7.02.97 р. Це імуноферментні набори для виявлення антихламідійний антитіл класів Ig G, Ig A, Ig M з визначенням їх кількісного титру в сироватці крові по одній точці. Антиген отримано методами генної інженерії. В якості антигену твердої фази використовується специфічні рекомбінантні ліпополісахарідной фрагменти хламідій, відсутні в ліпополісахариди інших бактерій. Вибираючи тест-систему, де в якості антигену використовуються ліпополісахарідной фракції, ми виходили з припущення, що обстежувана особа може протягом життя піддаватися інфікування не тільки C.trachomatis, але і С.pneumonia, і C.psitacci з виробленням до них відповідних антитіл. Виявлення їх кількісного титру та його динаміки є найважливішим показником ефективності проведеного лікування.

У проміжку між п'ятим і двадцятим днями після появи клінічних симптомів захворювання послідовно виникають антитіла цих трьох класів до специфічного хламидийном ліпополісахаридів. Ig M є маркером гострої стадії, він визначається вже через п'ять днів після початку захворювання. Зміни продукування Ig M на обумовлений продукування Ig А може відбуватися протягом 10 днів після появи симптомів захворювання. Протягом короткого періоду можуть одночасно бути присутнім Ig M і Ig А. У цей же час або з невеликою затримкою - 2-3 тижні можуть бути визначені Ig G. Прогресування захворювання, перехід у хронічну стадію характеризується появою Ig A. Ig G-антитіл (дивись таблицю 3).

Таблиця 3. Визначення стадії захворювання на підставі виявлення антитіл класів Ig G, Ig A, Ig M

Стадія захворювання Класи антитіл
Гостра Ig G, Ig А, Ig M
Хронічна Ig A *, Ig G
Реактивація або реінфекція Ig A *, Ig M
Стан після реконвалесценції Ig G

*- З недостовірним визначенні титру Ig А підтвердження здійснюється за допомогою визначення Ig M.

Для адекватної інтерпретації результатів серодіагностики хламідіозу слід визначати таке поняття як 'прикордонні титри Це найменші можливі розведення в яких тест-системи визначають антитіла проти хламідій. "Прикордонні титри" для Ig M - 1:50, Ig А-1: 50, Ig G-1: 100. Так звані "діагностичні титри" можуть підтверджувати клінічний діагноз, стадію процесу необхідність призначення антибактеріального лікування (дивись таблицю 4). При реінфекції і реактивації відбувається стрибкоподібний підйом титрів Ig G зміни титру Ig А йдуть паралельно з титром Ig M однак на більш низькому рівні. У осіб, які не отримують у період реінфекції лікування, титр Ig G зберігається на незмінному рівні. Виявлення протягом тривалого періоду титру тільки Ig G вказує на стан реконвалесценції після перенесеної хламідійної інфекції ("серологічні шрами"). Досліджуючи титри антитіл Ig G, Ig A, Ig M можна оцінювати ефективність проведеного лікування у віддаленому періоді (через 1-1,5 місяця).

У табл. 5-17 показана можливість визначення стадії інфекційного процесу, показань до антибактериальному лікуванню і винесення висновку про наявність хламідііной інфекції на підставі одноразового або динамічного визначення титрів антитіл IgG, IgA, IgM.

Таблиця 4. Діагностичний діапазон титрів антитіл Ig G, Ig А, IgM. Виявлення на основі його оцінки стадії захворювання, обгрунтованості призначення антибактеріального лікування.

Стадія захворювання Діпазон титрів IgG Діапазон титрів IgA Діапазон титрів Ig M
Первинна / гостра. Визначаються Ig M > 100-6400

> 50-1600


> 50-3200
Хронічна. Визначаються Ig A > 100-1600

<50

> 50-200
Реактивація / Реінфекція. Визначаються Ig G, Ig A > 100-51200 > 50-400

<50

Стан після реконвалесценції. Визначається Ig G > 100-400

<50

<50

Розглянемо можливість визначення стадії інфекційного процесу, показань до антибактериальному лікуванню і винесення висновку про наявність хламідійної інфекції на підставі одноразового або динамічного визначення титрів антитіл Ig G, IgA, Ig M.

Використовуючи дані одноразового дослідження важко винести клінічне висновок (табл. 5), при дослідженні сироватки через 10-14 днів вже можна судити про наявність хламідійної інфекції та показанні до призначення антибактеріального лікування (табл. 6) або про їх відсутність (табл. 7)

Таблиця 5. Дуже рання стадія інфекції (сумнівно). "Прикордонні титри" у першій сироватці

Титр Ig G Титр Ig А Титр Ig M Висновок про наявність хламідійної інфекції Антибактеріальне лікування

<100

| <50

| <50

сумнівно не показано

Таблиця 6. Гостра первинна інфекція. "Діагностичні титри" у другій сироватці через 10-14 днів

Титр Ig G Титр Ig А Титр Ig M Висновок про наявність хламідііной інфекції Антибактеріальне лікування
> 200 > = 100

= <50

є Показано

Таблиця 7. Відсутність хламідійної інфекції. "Діагностичні титри" у другій сироватці через 10-14 днів

Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Висновок про наявність хламідійної інфекції Антибактеріальне лікування

<100

<50

<50

відсутня не показано

При одноразовому визначенні титрів антитіл (табл. 8) так само, як і в попередньому спостереженні важко однозначно винести клінічне висновок Повторне обстеження хворого через два тижні (табл. 9) дозволяє судити про прогресування первинної інфекції або реактивації і реінфекції. В іншому випадку (табл. 10) дослідження сироватки в динаміці через два тижні дозволяє винести висновок про персистенції антитіл і непоказании антибактеріального лікування

Таблиця 8. Рання стадія інфекції (сумнівно). Хронічний перебіг (сумнівно). "Прикордонні титри в першій сироватці"

Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Висновок про наявність хламідійної інфекції Антибактеріальне лікування
100 50

<50

Сумнівно (потрібне підтвердження ПЛР та культуральними посівом) не обов'язково

Таблиця 9. Прогресуюча первинна інфекція. Реінфекція. Реактивація. Діагностичні титри у другій сироватці через 10-14 днів

Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Висновок про наявність хламідійної інфекції Антибактеріальне лікування
> = 400 * > = 200 *

<= 50

Є показано

*- 4-х кратне підвищення значимо тільки для Ig G і Ig А.

Таблиця 10. Хронічна персистенція антитіл без клінічних проявів. Діагностичні титри у другій сироватці через 10-14 днів.

Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Висновок про наявність хламідійної інфекції Антибактеріальне лікування
100 50

<= 50

Персистенція антитіл не показано

У наступному спостереженні (табл.11) можна відразу винести висновок про первинної інфекції або про її прогресуванні або реактивації, реінфекції (табл. 12) і, відповідно, свідчення антибактеріального лікування.


Таблиця 11. Первинна стадія. Діагностичні титри у першій сироватці

Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Висновок про наявність хламідійної інфекції Антибактеріальне лікування

<100

<50

> = 50 Є Показано
> = 100 > = 50 > = 50 Є Показано

<100

> = 50 > = 50 Є Показано

Таблиця 12. Прогресуюча первинна інфекція. Реінфекція. Реактивація. Діагностичні титри перший сироватки

Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Висновок про наявність хламідійної інфекції Антибактеріальне лікування
> = 400 > = 200

<50

є показано

У наступному спостереженні первинне дослідження не дає підстав для висновків (табл.13), і тільки повторення його через два тижні дозволяє винести висновок. Відсутність зміни титру антитіл (табл.15) за зазначений період часу свідчить про персистенції хламідій, що викликають утворення Ig А-антитіл і про відсутність показань до призначення антибактеріального лікування. В іншому випадку (табл.14) збільшення у 2 рази титрів Ig G і Ig A дозволяє зробити висновок про присутність хламідійної інфекції та наявності показань до призначення антбактеріального лікування.

Таблиця 13. Первинна інфекція (сумнівно). Реінфекція (сумнівно). Реактивація (сумнівно). "Прикордонні титри" у першій сироватці

Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Висновок про наявність хламідійної інфекції Антибактеріальне лікування

<100

50-100

<50

Можлива Сумнівно. Не обов'язково

Таблиця 14. Первинна інфекція. Реінфекція. Реактивація. "Діагностичні титри" у другій сироватці через 10-14 днів

Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Висновок про наявність хламідійної інфекції Антибактеріальне лікування
> = 200 > = 200

<50

Є Показано

Таблиця 15. Хронічна персистенція антитіл без клінічних проявів. Діагностичні титри у другій сироватці через 10-14 днів.

Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Висновок про наявність хламідійної інфекції Антибактеріальне лікування

<100

50-100

<50

Присутній персистуючі хламідії, викликають утворення IgA-антитіл. Клінініческое значення невідоме. Не показано

У разі обстеження реконвалесцентів або при виявленні підвищених титрів IgG, розцінюються як "серологічна знахідка" (табл. 16), динамічне спостереження за два тижні в разі відсутності 4-х кратного підвищення титру Ig G дозволяє винести висновок про неінфіцірованності і непоказании антибактеріального лікування (табл . 17)

Таблиця 16. Стан після реконвалесценції - "залишкова серологія" (сумнівно). Прикордонні титри в першій сироватці.

Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Висновок про наявність хламідійної інфекції Антибактеріальне лікування
> = 10

<50

<50

Сумнівно необхідні проведення ПЛР, культ. посіву Сумнівно

Таблиця 17. Стан після реконвалесценції - "залишкова серологія". Діагностичні титри у другій сироватці через 10-14 днів.

Титр Ig G Титр Ig A Титр Ig M Висновок про наявність хламідійної інфекції Антибактеріальне лікування
> = 100 *

<50

<50

Відсутній Не показано

* - У разі відсутності 4-х кратного підвищення титру між першою і другою сироватками. Якщо це підвищення є, то зазначається поточна інфекція.


З січня 1999 р. на російському ринку з'явилися тест-набори С. trachomatis Ig G і Ig A pELISA medac. Вони використовують синтетичний пептид з іммунодомінантной області МОМР. З допомогою цього високоспецифічний антигену можливе виділення С. trachomatis - специфічних антитіл з високою чутливістю серед загальних антихламідійний антитіл з високим ступенем чутливості.

Переваги тесту:

-Відсутність хибнопозитивних результатів, обумовлених міжвидової перехресної реакцією хламідій;

-Відсутність інфікованого антигенного матеріалу;

-Хімічно точна структура антигену;

-Наявність стрипів дозволяє економічно використовувати тести;

-Придатний для використання на автоматичних відкритих системах для ІФА.


ЗАТ "Вектор-Бест" (Новосибірськ) виробляє такі тест-системи для діагностики хламідіозу методом ІФА:

- ХламіБест-Ig G-стрип для виявлення імуноглобулінів класів G до С. trachomatis і С. psittacci в сироватці крові;

- ХламіБест-Trachomatis Ig G-стрип. Тест-система імуноферментна для виявлення імуноглобулінів класу G до Chlamydia trachomatis в сироватці (плазмі) крові;

-ХламіБест-Ig M - стріп. Тест-система імуноферментна для виявлення імуноглобулінів класу М до Chlamydia trachomatis і Chlamydia psrttaci;

- ВектоХламі-антиген-стрип. Тест-система для виявлення антигену Chlamydia trachomatis. Хромоген-ОФД.

-ВектоХламі-антиген-стрип. Тест-система для виявлення антигену Chlamydia trachomatis.


Є реактиви різних фірм для експрес-діагностики хламідійної інфекції, облік реакції через 10-15 хвилин візуальний. Однак чутливість цих методів невисока - 50-60%, вони можуть бути використані тільки для скринінгове досліджень.



Діагностика хламідій на культурі клітин МсСоу

Одним з кращих, але в той же час найбільш трудомістким є метод діагностики хламідій шляхом ізоляції збудника на культурі клітин, оброблених різними антиметаболитами ("золотий стандарт") Для цієї мети зазвичай використовують чутливу культуру клітин, оброблену циклогексимід. Чутливість культурального методу в порівнянні з ПЛР становить 70-80%, але в той же час він перевершує молекулярно-біологічні методи діагностики по специфічності. У літературі описані випадки виявлення хламідій трахоматіс методом ПЛР при негативних результатах культурального тесту і навпаки.

Показаннями для діагностики хламідійної інфекції цим методом є:

1 Вагітність з обтяженим акушерським анамнезом.

2. Оцінка ефективності проведеного антибактеріального лікування.

3. Виявлення чутливості та резистентності до антибактеріальних

препаратів.

4. Виявлення хламідій у ВІЛ-інфікованих або осіб з вторинними імунодефіцитними станами (онкологічні хворі після проведених курсів променевої та хіміотерапії, трансплантації кісткового мозку; особи, які отримують імунодепресанти; хворі на вірусний гепатит і туберкульоз).

5. Безпліддя неясного генезу.

6. Встановлення етіології хронічного інфекційного процесу урогенітального тракту.

Культуральний посів є референс-методом при оцінці ефективності антибактеріального лікування. При дослідженні біопроб методом ПЛР після курсу хіміотерапії в деяких випадках можна отримати "хибнопозитивні з клінічної точки зору" результати. Це пов'язано з тим, що неможливо однозначно оцінити життєздатність і патогенність мікробної клітини на підставі виявлення фрагмента її геному, використовуючи лише дані молекулярно-біологічних методів. У цьому випадку при дослідженні клінічного матеріалу за допомогою культурального посіву мікробні клітини, що втратили ці важливі з клінічної точки зору властивості, не дадуть зростання в клітинній культурі.

Для транспортування і зберігання клінічного матеріалу використовують спеціальне поживне середовище (транспортне середовище). Вона розливається в Пеніцилінові флакони по 1 мл і зберігається при температурі + 4 ° С (у загальній камері побутового холодильника) протягом 2-х місяців. Склад транспортного середовища: середовище MEM з додаванням 10% сироватки великої рогатої худоби і антибіотика гентаміцину концентрації 50 мкг / мл.

Клінічний матеріал після перенесення в транспортну середу зберігається в загальній камері холодильника при температурі + 4 ° С і, протягом двох діб має бути доставлений в лабораторію.

Процедура посіву

1. Обробка одноденною клітинної культури МсСоу 1% розчином ДЕАЕ декстраном протягом 30 хвилин.

2. Зараження оброблених клітин матеріалом, отриманим від хворих.

3. Центрифугування заражених клітин при 2500 g протягом 45 хвилин.

4. Відмивання клітин живильним середовищем.

5. Додавання до клітин ростової середовища, що містить циклогексимід.

6. Инкубирование клітин протягом двох діб при +36 ° С.

7. Виявлення хламідій в клітинах методом прямої імунофлюоресценції або ПЛР.

Реальний термін отримання результатів цим методом - сім днів.


Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Медицина | Реферат
77.2кб. | скачати


Схожі роботи:
Хламідіоз
Перинатальний хламідіоз
Хламідіоз свиней
Хламідіоз овець
Урогенітальний хламідіоз
Хламідіоз в гінекологічній практиці
Хламідіоз великої рогатої худоби 2
Хламідіоз великої рогатої худоби
Хламідія Хламідіоз Лікування хламідіозу

Нажми чтобы узнать.

В даний час в літературі зростає кількість повідомлень про випадки резистентності хламідій до антибактеріальних препаратів (еритроміцину, тетрацикліну, доксицикліну, фторхінолонів). Цінність культурального методу полягає в тому, що він є поки єдиним методом, що дозволяє вибрати антибактеріальний препарат для лікування хламідійної інфекції та оцінити ефективність антибактеріальної терапії.

Схема методу виявлення стійкості хламідій трахоматіс до антибактеріальних препаратів

-Хламідійну ізолятів, виділених від хворого при посіві, заражають чутливі клітини.

-К зараженим клітинам додають ростовую середу, що містить антибіотик.

-Заражені клітини інкубують 5 днів при температурі + 36 ° С.

-Чутливість хламідій до антибіотика визначається за придушення інфекції в заражених клітинах. Процедура тривала, займає за часом два тижні.



Діагностика Chlamydia trachomatis методом полімеразної ланцюгової реакції

Дорожнеча, тривалість і трудомісткість мікробіологічного виділення хламідій в культурі істотно ускладнює використання цієї процедури в рутинній лабораторній діагностиці. У літературі накопичений великий клініко-лабораторний досвід з використання методу ПЛР для виявлення хламідій трахоматіс. Особливу увагу при його використанні слід приділяти, без сумніву, питань правильної інтерпретації одержуваних результатів. Екстремально високі показники чутливості і специфічності ПЛР роблять цю методику в чому революційної в лабораторній діагностиці. Основними мішенями при виявленні хламідій трахоматіс є нуклеотидна послідовність видоспецифической кріптіческой плазміди, послідовність головного білка внутрішньої мембрани, рибосомальні гени.

Дана реакція являє собою багаторазово повторювані цикли синтезу (ампліфікацію) специфічної області ДНК-мішені в присутності термостабільної ДНК-полімерази, дезоксинуклеотидтрифосфатов, відповідного сольового буфера і олігонуклеотидних запалів-праймерів, що визначають межі ампліфікується ділянки. Кожен цикл складається з трьох стадій з різними температурними режимами. На першій стадії при 94 ° С відбувається розділення кіл ДНК, потім при 56-58 ° С - приєднання (відпал) праймерів до комплементарним послідовностей на ДНК-мішені, і при температурі 72 ° С перебігає синтез нових ланцюгів ДНК шляхом добудови ланцюгів праймерів у напрямку 5 '-3'. У кожному циклі відбувається подвоєння числа копій ампліфікується ділянки, що дозволяє за 25-40 циклів напрацювати фрагмент ДНК, обмежений парою вибраних праймерів, в кількості, достатній для її детекції за допомогою електрофорезу або альтернативними йому технологіями

У порівнянні з широко застосовуються імунологічними тестами ПЛР-діагностика має низку переваг:

-Високої і регульованої специфічністю, зумовленою лише нуклеотидної послідовністю, яка застосовується в даній діагностичній системі;

-Високою чутливістю, що дозволяє діагносціровать не тільки гострі, а й латентні інфекції (можливе виявлення навіть поодиноких бактерій або вірусів);

-Хімічне подібність всіх нуклеїнових кислот дозволяє розробляти універсальні процедури для виявлення різних інфекційних агентів,

-Можливістю ідентифікації збудника протягом 4,5-5 годин.


Доставка біоматеріалу в ПЛР-лабораторію проводиться в холодовому термоконтейнері або термосі з льодом. Важливою відмітною особливістю ПЛР-діагностики є відносно низька вартість обладнання для проведення аналізу, що поєднується з універсальністю методу, що дозволяє виявляти весь спектр клінічно актуальних інфекційних агентів.


ПЛР-лабораторія повинна бути розділена на зони (кімнати). Слід мати не менше двох кімнат

-Пре-ПЛР-приміщення, де проводиться обробка клінічних зразків, виділення ДНК, приготування реакційної суміші для ПЛР та постановка ПЛР (за наявності умов два останні етапи рекомендується також проводити в додатковому окремому приміщенні), у цих приміщеннях забороняється проводити всі інші види робіт з інфекційними агентами (мікробіологічний аналіз, ІФА, інші діагностичні тести), ПЛР-діагностика яких проводиться в даній лабораторії.

-Пост-ПЛР-приміщення, де проводиться детекція продуктів ампліфікації, в ПЛР-приміщенні допускається використовувати інші методи детекції інфекцій, діагностика яких проводиться в даній лабораторії. Кімнату детекції продуктів ампліфікації (пост-ПЛР-приміщення) слід розташовувати якомога далі від пре-ПЛР-приміщень. Слід виключити рух повітряного потоку з пост-ПЛР-приміщення в пре-ПЛР-приміщення.

У кімнаті приготування реакційної суміші і в кімнаті обробки клінічних зразків повинні бути встановлені ультрафіолетові лампи, робочі поверхні в лабораторії повинні оброблятися дезінфікуючими розчинами.

Показання для діагностики С. trachomatis методом ПЛР

1. Гостра фаза захворювання

2. Хронічна фаза захворювання

3. Встановлення етіології хронічного інфекційного процесу урогенітального тракту.

4. Вагітність з обтяженим акушерським анамнезом. 5 Безпліддя неясного генезу.

6. Контроль ефективності проведеного антибактеріального лікування.

У разі виявлення фрагмента ДНК хламідії трахоматіс після курсу хіміотерапії слід провести культуральну діагностику для виключення "хибнопозитивного з клінічної точки зору результату". Якщо проведення культуральної діагностики неможливо, то необхідно через 5-6 тижнів (повне оновлення епітеліального покриву сечостатевих шляхів) провести повторне дослідження методом ПЛР.

7. Виявлення хламідії у ВІЛ-інфікованих осіб, хворих на туберкульоз, вірусний гепатит і з вторинними імунодефіцитними станами (онкологічні хворі після курсів хіміо-і променевої терапії, трансплантації кісткового мозку, які отримують імуносупресивну терапію).

У 1991 році компанія Хоффман-ла Рош ЛТД отримала від компанії Cetus права і патенти на використання ПЛР. У цьому ж році була створена Roche Molecular Systems, що займається виключно питаннями розвитку та вдосконалення ПЛР. У 1992 році були впроваджені перші стандартизовані тест-системи для клінічної ПЛР-діагностики AMPLICOR Chlamydia trachomatis, а в 1993 році розпочато виробництво цих тест систем. Численні проведені дослідження показали високу чутливість і специфічність даного набору. Це дозволило отримати даної тест-системі сертифікат Food and Drug Administration (FDA) в 1993 році. У 1995 році з'явився новий набір AMPLICOR Chlamydia trachomatis / Neisseria gonorrhoeae для одночасної їх детекції в одній пробірці. У тесті використані біотінілірованние праймери (СР24/СР27) з кріптіческой плазміди С. trachomatis. Чутливість тесту складає 10 копій / мл, специфічність 99,6%. Тест-система включає: набір для збору та транспортування зразків, набір для виділення ДНК з цервікальних, уретральних зразків і сечі, набір для ампліфікації та детекції. Всі набори стандартизовані, повністю готові до використання, мають внутрішній контроль, систему захисту від контамінації.

Науково-виробничою фірмою "Літех" при НДІ фізико-хімічної медицини МОЗ РФ випускається набір реагентів "Полімік" у вигляді трьох окремих наборів для визначення відповідно Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum. Кожен набір "Полімік" комплектується окремим набором для виділення ДНК з біопроб. Інструкція по застосуванню набору реагентів рекомендована до затвердження експертною комісією Комітету з нової медичної техніки МОЗ РФ (протокол No 3 від 18.03.96 р.) і затверджена Міністерством охорони здоров'я РФ 17.05.96 р. (ТУ 9398-405-17253567-96).

До складу реакційної суміші набору "Полімік" входить внутрішній контроль (рекомбінантна плазміда, що містить фрагмент-вставку розміром 308 н.п.). Цей компонент дозволяє контролювати процес проходження реакції ампліфікації, а також тестувати наявність у пробах речовин, що пригнічують ПЛР. Смуга, відповідна внутрішнього контролю, повинна проявлятися як у позитивному і в негативному контролях, так і у всіх тестованих пробах.

При виділенні ДНК із біопроби ("Набір для виділення ДНК") використовується метод екстракції ДНК з клітин хламідій за допомогою гуанідину тіоціанат і зв'язування вивільняються нуклеїнових кислот з частинками крупнопористого скла. Це дозволяє оптимізувати умови виділення і підготовки проб для ампліфікації, а також зменшити кількість маніпуляцій із зразком. При цьому всі маніпуляції проводяться в одній пробірці. Вихід хромосомної ДНК становить 70-80% за результатами визначення числа колонієутворюючих одиниць клітин Acholeplasma laidlawii (штам мікоплазм, взятий в якості стандарту) як у випадку чистої культури, так і при додаванні цих клітин до клінічного матеріалу, який не містить визначених інфекційних агентів.

Після завершення ПЛР продукти ампліфікації фракционируют методом електрофорезу в 1,5% агарозному гелі.

Аналіз результатів діагностики

1. У позитивному контрольному зразку для хламідій виявляється смуга розміром 501 н.п.

2. У негативному контрольному зразку смуга, відповідна фрагментами геному хламідій, має бути відсутня. Поява смуги в негативному контролі свідчить про контамінації компонентів набору.

3. В аналізованій пробі відсутність смуги строго на рівні відповідного контролю свідчить про відсутність збудника в пробі, наявність смуги, відповідної за електрофоретичною рухливості позитивного контролю, свідчить про наявність хламідій в клінічній пробі.

4. У всіх зразках виявляється смуга оранжево-червоного кольору, відповідна внутрішнього контролю розміром 308 н.п. Отримані результати можна документувати фотографуванням гелів з використанням оранжевого або інтерференційного (594 нм) світлофільтра. При використанні відеосистеми "Gel-doc" можливо документування результатів електрофорезу у вигляді комп'ютерного файлу, доступного будь-якій програмі "Windows".

Набір "Полімік" слід зберігати при температурі - 18-20 ° С протягом усього терміну придатності (6 місяців). Допускається, зберігання і транспортування набору при температурі не вище 0 ° градусів не більше однієї доби.

За станом на третій квартал 1999 р. Міністерством охорони здоров'я Росії крім набору "Полімік" дозволені наступні діагностичні набори для виявлення хламідій трахоматіс методом ПЛР в якості виробів медичного призначення:

набір реагентів ампліфікаціонний для визначення ДНК хламідій (Хламідія-Амплі-тест) ТУ 9398-402-18137053-96 виробництва АТ "ВНЦМДЛ", Москва;

набір реактивів для виявлення нуклеотидних послідовностей хламідія трахоматіс методом ПЛР (Хлам Ам) ТУ "9398-403-29032954-96 виробництва ЗАТ" Впровадження систем у медицину ". Москва,

набір реагентів для виявлення ДНК хламідій трахоматіс методом ПЛР (Хлам-Ген) ТУ 9398-412-46482062-97 виробництва НПФ "ДНК-технологія", Москва.



Переваги і недоліки різних методів виявлення Chlamydia trachomatis

(Taylor-Robinson О., Thomas BJ, 1991, з доповненнями Говорун В.М, Бочкарьов Є.Г., Парфьонова Т.М., 1999)


Характеристика / Метод ПІФ Культуральний посів ІФА-методи ПЛР
Досліджуваний матеріал Будь-який Більшість Обмеження з-за відсутності адресності реакцій Будь-який
Значення правильно взятих проб Вирішальне Вирішальне Вирішальне Вирішальне
Умови транспортування проб Якщо препарат фіксований-умови не важливі Швидка доставка чи зберігання при низькій температурі Не має значення, якщо проба взята в буфер

Швидка доставка чи зберігання при низькій t o менш важливо, ніж для культури клітин

Умови зберігання На короткий час при +4 ° С тривало при -20 ° С +4 ° С - добу-дві. Довгих зберігання в рідкому азоті 3 -5 днів при +4 ° С Заморожування знижує чутливість На короткий час + 4 ° С, два тижні - 20 ° С Тривалий час - в рідкому азоті
Перевірка адекватності взяття матеріалу Мазки оцінюють під час тестування Не практикується Не практикується Визначається, чи присутній ДНК.
Потреба в спеціальному обладнанні Люмінесцентний мікроскоп Центрифуга Комплект для ІФА Ампліфікатор й устаткування для електрофорезу
Обробка проб Проста Трудомістка Стає простіше для нових тестів Вимагає суворої обережності, щоб не контамінувати ДНК
Читання результатів Суб'єктивне і стомлююче Суб'єктивне помірно втомлива Об'єктивне, Просте Об'єктивне, просте
Час виконання 30 хвилин 12-72 години 3:00 4,5-5 годин
Способи перевірки результатів Повторний перегляд Повторний перегляд Повторення тесту Повторна проба або переварювання ендоуклеазой
Результат залежить від наступних причин: Досвіду мікроскопісту Чутливості клітинної культури Властивою потужності тесту Вимагає гарного контролю та отсуствія контамінації
Здатність до підтримки штаму Ні Так Ні Ні
Використання як контролю ефективності лікування Обмежено Рекомендується Обмежено Рекомендується з обмеженнями
© Усі права захищені
написати до нас
Рейтинг@Mail.ru