додати матеріал

приховати рекламу

Ферменти

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

Ферменти
Можливість проведення різних маніпуляцій з ДНК in vitro цілком залежить від наявності очищених ферментів, які специфічним чином розрізають, модифікують і з'єднують молекули. В даний час відсутні чисто хімічні методи, за допомогою яких можна було б здійснювати перебудову молекул ДНК з такими селективністю і різноманітністю, які характерні для ферментативних реакцій. У той же час навіть за допомогою досить невеликого числа ферментів можна отримувати рекомбінантні молекули ДНК. Більшість цих ферментів були відкриті за обставин, не пов'язаних з їх використанням при маніпулюванні з молекулами ДНК. Насправді кожен фермент відіграє важливу роль каталізатора в тому чи іншому хімічному процесі, що протікає в організмі, з якого він виділений. Використання ферментів в якості інструменту при маніпулюванні з ДНК залежить, зокрема, від їх доступності та стабільності, а особливо від їхньої чистоти, і перш за все від того, чи вільні вони від домішок, що впливають на ферментативну активність.
Різні екзонуклеазами розщеплюють ланцюг переважно або з 5'-, або з 3'-кінця, але іноді вони не виявляють такої специфічності. Ендонуклеаза вільні кінці не потрібні, тому дані ферменти можуть гідролізувати кільцеві молекули ДНК. Розрізання здійснюється за внутрішнім фосфодіефірних зв'язків, при цьому утворюються фрагменти різної довжини. За допомогою екзонуклеазами теж можуть утворюватися короткі полінуклеотидні фрагменти, проте кінцевим продуктом в багатьох випадках є нуклеозідмонофосфати, оскільки екзонуклеазами здійснюють гідроліз, отщепляя послідовно один залишок за іншим.
Нарешті, нуклеази відрізняються одна від одної з того, з якого боку від міжнуклеотидних фосфодіефірних містка здійснюється гідроліз. Одні ферменти роблять розріз між фосфатом і 3'-гідроксильної групою з утворенням 5'-фосфомоноефірних продуктів, інші - між фосфатом і 5-гідроксильною групою.
Нуклеази
а. Загальні властивості
Нуклеази дозволяють специфічним чином модифіковані молекули ДНК і РНК. Кожен фермент може бути віднесений до того або іншого класу відповідно до його специфічністю або типом реакції, яку він каталізує. Так, ряд ферментів, подібно рестріктірующім ендонуклеаза, діє тільки на ДНК. Інші, подібно панкреатичної РНКаза, гідролізують тільки РНК. Є ферменти, які використовують в якості субстратів як ДНК, так і РНК. Одні нуклеази переважно діють або на дволанцюжкові, або на одноланцюгові полінуклеотидні субстрати, інші не виявляють такої вираженої переваги.
Нуклеази можна також розділити на дві наступні категорії: екзонуклеазами і ендонуклеази.
Більшість ферментів згадуються в тексті цієї книги. Нуклеази, відмічені зірочкою, використовуються як рутинні реактиви в експериментах з отримання рекомбінантних молекул ДНК і тому розглядаються більш детально.
б. Нуклеази, специфічні у відношенні одноланцюжковою ДНК
Ендонуклеази. Деякі ендонуклеази гідролізують одноланцюгові молекули ДНК приблизно в тисячу разів швидше, ніж дволанцюжкові. Така специфічність використовується в багатьох експериментах - при конструюванні рекомбінантних ДНК, при гетеродуплексном аналізі і навіть при аналізі експресії генів. Деякі реакції, каталізуються подібними ендонуклеаза.
Кілька різних ендонуклеаз такого типу були досить добре очищені й охарактеризовано, щоб їх можна було використовувати в якості реактивів. Одна з них, Нуклеази S1, отримана з висушених препаратів цвілеподібного гриба Aspergillus oryzae; джерелами двох інших широко використовуваних ферментів є Neurospora і Mung beans. Кожен з цих трьох ферментів проявляє максимальну активність і точність розпізнавання одноланцюгових і дволанцюжкові молекул при певних умовах. Всі три ферменти гідролізують як ДНК, так і РНК. При розриві фосфодіефірних зв'язків з допомогою цих ферментів утворюються 5'-монофосфатние і З "-гідроксильні кінці.
Екзонуклеазами. Екзонуклеазами E. coli exo VII специфічна у відношенні одноланцюгових ДНК. Вона володіє незвичайною екзонуклеазну активністю в тому сенсі, що ініціює відщеплення як з 5'-, так і з З "-решт ланцюга, в той час як найбільш відомі екзонуклеазами специфічні до якогось одного кінця. Продуктами гідролізу окремих ланцюгів екзонуклеазами ехо VII є олігонуклеотиди довжиною приблизно 25 мономерних одиниць, які містять 5'-фосфомоноефірние кінцеві групи.
в. Нуклеази Bal 31
Псевдомонад Alteromonas espejiana секретує єдину дезоксирибонуклеаза, що отримала назву Bal 31. У відношенні одноланцюжковою ДНК, в тому числі одноланцюгових ділянок дволанцюжкової ДНК, Bal 31 веде себе як ендонуклеаза, діючи аналогічно до інших ендонуклеаза, специфічним до одноланцюговим ДНК. Проте відносно інтактною дволанцюжкової ДНК цей фермент проявляє екзонуклеазна активність, мабуть, завдяки тому, що він здатний розпізнавати локальні одноланцюгові ділянки. Bal 31 розрізає обидві ланцюга на обох кінцях дуплексу, тобто здійснює деградацію одночасно в напрямках 3 '-> 5' і 5'-> 3 '. У результаті дволанцюжкова молекула поступово коротшає. Якщо емпірично оцінити швидкість цього процесу, то за допомогою ферменту Bal 31 можна отримувати фрагменти ДНК потрібної довжини. Хоча вкорочення різних молекул ДНК відбувається несинхронно, виходить набір фрагментів, довжина яких близька до заданої. У результаті вичерпного гідролізу за допомогою Bal 31 проміжні олігонуклеотидно продукти розщеплюються до 5'-мононуклеотидів.
р. РНКази Н
Існує група ферментів, що одержали назву РНКази Н тому, що вони специфічно розщеплюють ланцюг РНК в гібридному дуплексі РНК-ДНК. РНКаза Н E. coli є ендонуклеази, продуктами дії якої є олігорібонуклеотіди з 5'-фосфомоноефірнимі кінцями. Цей фермент широко використовується як реактив. Клітини еукаріот теж містять подібну ендонуклеолітіческую РНКаза Н. РНКаза Н-екзонуклеолітіческая активність властива екзонуклеазами III E. coli і зворотним транскриптаза, кодуються ретровірусами. Екзонуклеазами III розщеплює РНК до 5'-нуклеозид-монофосфату в напрямку З "-> 5 ', а продуктами гідролізу ланцюга РНК за допомогою зворотної транскриптази є 5'-фосфорильовані олігорібонуклеотіди довжиною від двох до десяти нуклеотидів.
Рестриктази
Еволюція наділила різні види бактерій унікальними ендонуклеаза, що дозволяють їм відрізняти їх власну ДНК від чужорідної. Тим самим природа забезпечила вчених багатим набором високоспецифічних реактивів для розщеплення ДНК. При вивченні ДНК велике значення мають дві важливі особливості рестріктірующіх ендонуклеаз. Перша пов'язана з чудовою здатністю ферменту дізнаватися специфічні короткі нуклеотидні послідовності в ДНК. Друга полягає в тому, що існує велика кількість різних ендонуклеаз рестрикції, кожна з яких дізнається специфічну послідовність.
а. Три типи ендонуклеаз рестрикції
Ендонуклеази типів I та І. Ферменти, які відносяться до групи ендонуклеаз типів I і II, - це складні білки, що мають активностями рестріктірующей ендонуклеази і метилаза. Ці цікаві ферменти не використовуються, однак, при конструюванні рекомбінантних молекул ДНК. Ферменти типу I зв'язуються з ДНК у специфічних ділянках і потім проводять дволанцюжкові розрізи на різній відстані від сайтів впізнавання, варіюється від 400 пар основ до 7 т.п.н. Для здійснення ферментативного гідролізу ДНК необхідні Mg 2 +, ATP і S-аденозілметіонін. Останній активує фермент. Розрізання супроводжується гідролізом АТР, при цьому фермент втрачає ендонуклеолітіческую активність, але зберігає АТРазною. Таким чином, ендонуклеази типу I є ДНК-залежними АТРази. Крім того, вони представляють собою сайтспецифической метилаза, що каталізують утворення 6-метіладенінових залишків у сайті впізнавання. Наприклад, сайтом впізнавання для ферменту з E. coli K12 є
5'-AACNNN NN N GTGC-3 '3-TTGNNNNNNCACG-5'
де N - будь-яку підставу, a N-комплементарное йому підставу. Ендонуклеаза розрізає ланцюг на значній відстані від сайту впізнавання, але при цьому метилювання з утворенням 6-метил-аденіну відбувається в межах цього сайту. Ендонуклеазною активність виявляється тільки при наявності повністю Неметиловані сайту. Сайт впізнавання для ферменту E. coli K12 складається з двох коротких специфічних олігонуклеотидів, розділених шістьма-вісьмома неспецифічними парами підстав. Така структура типова для сайтів впізнавання ферментів типу I, виявлених у різних штамів бактерій. Специфічні олігонуклеотидно послідовності для різних ферментів розрізняються, але метиловані залишки А завжди знаходяться в однакових позиціях.
Споріднені системи рестрикції-модифікації типу I кодуються алельними локулах геномів різних кишкових бактерій. З кожною системою пов'язані три зчеплених гена: hsdR, hsdM і hsdS, розташовані в порядку, відповідному порядку транскрипції. Поліпептидні продукти hsdM і hsdS транслюються з одного двухцістронной мРНК і разом складають метилазу. Перший з них має метілазной активністю, а другий здійснює сайтспецифической впізнавання. Продукт гена hsdR володіє ендонуклеазною активністю. Всі три поліпептиду містяться в різних пропорціях в активних препаратах ферментів типу I.
Ферменти типу III, так само як і ендонуклеаза типу I, мають нуклеазну і метілазной активностями. Однак, незважаючи на те, що ферменти типу III активуються S-аденозілметіонін і для своєї роботи вимагають АТР, вони не каталізують її гідролізу. Ендонуклеази типу III роблять дволанцюжкові розрізи в ДНК на відстані приблизно 25 bp від своїх сайтів впізнавання. У присутності АТР і S-аденозілметіонін ті ж ферменти каталізують сайтспецифической метилювання. Ферменти типу III-гетеродімерние білки. Їх субодиниці кодуються двома зчепленими генами, локалізованими у деяких штамів Е. coli у внехромосомних геномах. Кожен такий ген являє собою окрему транскрипційних одиницю. Один генний продукт дізнається специфічну послідовність і володіє метілазной активністю, інший виконує ендонуклеазною функцію.
Оскільки ферменти типу I не розрізають молекули ДНК на репродукуючі фрагменти і ендонуклеазною активності ферментів типу I і III конкурують з метилюванням, жоден з них не використовується в якості реагенту при отриманні рекомбінантних ДНК.
Ендонуклеази типу II. Рестріктірующіе ендонуклеази типу II є основним інструментом при конструюванні рекомбінантних молекул ДНК і при аналізі структури ДНК. Ці ферменти здатні впізнавати специфічні короткі нуклеотидні послідовності і зв'язуватися з ними, але на відміну від ендонуклеаз типів I і III вони виробляють дволанцюжкові розрізи за специфічними фосфодіефірних зв'язків або в межах самого сайту впізнавання, або на цілком певному невеликій відстані від нього. Один і той же фермент розрізає дану молекулу ДНК з утворенням однакових наборів фрагментів. Довжина фрагментів визначається відстанню між специфічними послідовностями, впізнаваними цим ферментом. Ферменти типу II гідролізують фосфодіефірні зв'язку між 3-гідроксильною групою і фосфатом, в результаті чого утворюється 5'-фосфомоноефірная група з одного боку від розриву і 3'-гідроксильна група - з іншого.
Сайт впізнавання і розрізання для рестріктірующей ендонуклеази Eco RI. Розрізання відбувається в два етапи: спочатку гідролізується один ланцюг, потім - інша. При звичайних умовах продуктами реакції є два дуплексних фрагмента з комплементарними одноланцюжковий кінцями. В умовах, які сприяють стабілізації водневих зв'язків між чотирма нуклеотидами з різних ланцюгів, фрагменти можуть реассоцііровать.
б. Типова рестріктірующая ендонуклеаза типу II
Ендонуклеаза Eco RI. Широко яка рестріктірующая ендонуклаза Eco RI розрізає ДНК в тих місцях, де зустрічається послідовність 5'-GAATTC-3 '. Як і у випадку інших рестріктірующіх ендонуклеаз типу II, ця послідовність є паліндромом, тобто в обох ланцюгах точно навпроти один одного знаходяться однакові послідовності, що читаються в напрямку 5'-> 3 '. Eco RI гідролізує фосфодіефірні зв'язку між залишками G і А в кожному ланцюзі. Оскільки ендонуклеаза Eco RI розрізає обидві ланцюга в тому місці, де зустрічається паліндромний послідовність 5'-GAATTC-3 ', молекула ДНК розрізається на характерний для неї набір фрагментів.
Липкі кінці. Ендонуклеаза Eco RI виробляє ступінчасті дволанцюжкові розрізи, при цьому у утворюються фрагментів ДНК на кінцях утворюються короткі комплементарні одноланцюгові хвости з чотирьох підстав - 5'-Аатте-3 '. У залежності від іонної сили розчину і температури ці комплементарні хвости або залишаються спареними, або денатурують, і тоді утворюються окремі фрагменти з короткими одноланцюжковий виступами на 5'-кінцях. За відповідних умов комплементарні хвости возз'єднуються. Одноланцюгові кінці, які утворюються при розщепленні ДНК ендонуклеаз Eco RI, отримали назву липких, оскільки вони здатні злучатися один з одним. Важливим наслідком освіти східчастих розривів є те, що фрагменти, що виходять в результаті обробки ендонуклеаз Eco RI двох різних ДНК, можуть з'єднуватися за допомогою липких кінців. При цьому відмінності, що зачіпають дволанцюжкові спіральні сегменти зазначених ДНК, на процес з'єднання не впливають.
Фермент. На відміну від рестріктірующіх ендонуклеаз типів I і III ферменти типу II, подібні Eco RI, не каталізують метилювання. Метілазную активність проявляє інший білок. Активна ендонуклеаза Eco RI представляє собою димер, що складається з двох ідентичних поліпептидних ланцюгів з мовляв. масою 31000. Виходячи з гомодимерних структури можна було б очікувати, що фермент буде діяти симетрично на ідентичні послідовності двох частин сайту впізнавання і розрізати обидві ланцюга одночасно. Однак насправді гідроліз відбувається послідовно.
Білок взаємодіє з ділянкою біля десяти пар основ; шість з них знаходяться в межах сайту впізнавання, інші є фланкирующие. Саме ці фланкирующие послідовності, мабуть, визначають вибір ланцюга, яка буде розрізана першою. Крім того, фланкирующие пари основ впливають на загальну швидкість розрізання в даному сайті впізнавання, так що в різних сайтах однієї молекули ДНК гідроліз здійснюється з різною швидкістю. Були отримані кристали комплексу Eco RI і олігонуклеотиду 5'-TCGCGAATTCGCG-3 'та проведено їх рентгеноструктурний аналіз. Це дозволило в деталях з'ясувати спосіб взаємодії даного ферменту і ДНК. Було встановлено, що між двома залишками аргініну і одним глутаматом, з одного боку, і парами основ в сайті впізнавання - з іншого, утворюються водневі зв'язки, внаслідок чого відбувається часткове розкручування По-ДНК. Про властивості інших рестріктірующіх ендонуклеаз типу II відомо значно менше, але, мабуть, вони аналогічні властивостям Eco RI.
в. Різні групи рестріктірующіх ендонуклеаз типу II
Великий каталог реактивів. У всіх ферментів виявлено близько 90 різних сайтів впізнавання. Кожен з ферментів отриманий з певного прокаріотів, що і відображено в його назві. Так, Eco RI веде своє походження з штаму Escherichia coli К12; Hae II і HaeIII - з Haemophilus aegyptius; Bam HI - з Bacillus amyloliquefaciens штаму H; Mbo I і Mbo II - з Moraxella bovis і т.д. Два різних ферменту, що мають однакові сайти впізнавання, називаються ізошізомерамі. Однак ізошізомери не обов'язково роблять розріз в одному і тому ж місці; порівняйте, наприклад, Xma I і Sma I.
Паліндромний сайти впізнавання і розрізання. Ендонуклеаза Eco RI - одна з багатьох рестріктірующіх ендонуклеаз типу II, які дізнаються різні паліндромний нуклеотидні послідовності і роблять розрізи, в результаті чого утворюються фрагменти з комплементарними одноланцюжковий хвостами. У межах цієї групи можна виділити кілька різновидів ферментів. Наприклад, Eco RI, Hind III і деякі інші ендонуклеази дізнаються послідовності з шести пар основ; ендонуклеаза Hinf I дізнається п'ять пар підстав, з яких центральним залишком може бути будь-який з чотирьох нуклеотидів. Еднонуклеаза Bgl I дізнається шість специфічних нуклеотидних залишків, але вони повинні бути розділені в середині будь-якими іншими п'ятьма парами підстав. Ендонуклеаза Not I має сайт впізнавання протяжністю вісім пар основ; такі ферменти, як Taq I і Mbo I, мають сайти впізнавання з чотирьох нуклеотидів. Інша відома особливість стосується властивостей одноланцюгових решт, що утворюються при дії різних рестріктірующіх ендонук-леаз. Ендонуклеази Eco RI, Hind III, Mbo I і Оа I утворюють одноланцюгові хвости, що складаються з 5'-кінцевих залишків кожного ланцюга, а ендонуклеази Pst I і Hae II - з 3'-залишків.
Ендонуклеази, що мають різні сайти впізнавання і розрізання, часто утворюють ідентичні липкі кінці. Наприклад, під дією ендонуклеаз Mbo I, Bcl I і Bam HI утворюються 5'-кінцеві 5'-GATC-3 '. У результаті фрагменти, що виходять при розщепленні даної ДНК будь-яким з цих ферментів, при змішуванні і відпалі будуть з'єднуватися один з одним. Однак фрагменти, що виходять з різних ДНК при розрізанні ендонуклеаз Bgl I, навряд чи будуть з'єднуватися при відпалі, оскільки одноланцюгові хвости можуть містити будь-яку послідовність з трьох нуклеотидів.
Інші рестріктірующіе ендонуклеази типу II також дізнаються специфічні паліндромний нуклеотидні послідовності, але розрізають фосфодіефірних місток в середині впізнаваною послідовності, в результаті чого утворюються фрагменти ДНК з тупими дволанцюжкові кінцями.
Непаліндромние сайти впізнавання з розрізанням на деякій відстані від них. Ферменти типу II, але іншого різновиду теж дізнаються специфічні нуклеотидні послідовності, але гідролізують фосфодіефірні містки поза цих послідовностей. При цьому впізнавана послідовність не є паліндромом. У цих випадках рестріктірующіе ендонуклеази, мабуть, «відраховують» точне число пар основ від впізнаваною послідовності і потім розрізають ланцюга. Механізм відліку такий, що місця гідролізу різних ланцюгів зміщені одна щодо іншої на один нуклеотид. У результаті утворюються фрагменти ДНК з одноланцюжковий виступами довжиною тільки в один нуклеотидний залишок.
р. Картирование сегментів ДНК за допомогою рестріктірующіх ендонуклеаз типу II
За допомогою рестріктірующіх ендонуклеаз можна розрізати складні геноми або довгі сегменти ДНК на відтворювані набори більш дрібних одиниць. У свою чергу такі одиниці можна розділити за розмірами з допомогою декількох методів. Найчастіше для цього використовують електрофорез фрагментів ДНК в напіврідкому гелі, приготованому на основі агарози або поліакриламіду. Зазвичай рухливість дволанцюжкової фрагмента в електричному полі обернено пропорційна логарифму його розміру. Використовуючи в якості маркерів фрагменти відомої довжини, легко визначити розмір даного нас фрагмента за допомогою лінійки і простого графіка. Для проведення такого аналізу звичайно достатньо менше 1 мкг ДНК, оскільки фрагменти легко виявляються при фарбуванні відповідним барвником, наприклад бромистим етидієм.
Набір фрагментів, які утворюються при розщепленні ДНК певної рестріктірующей ендонуклеаз, є своєрідним «відбитком пальців» цієї ДНК. Визначаючи, які фрагменти утворюються при розщепленні ДНК кількома рестріктазами окремо і в різних комбінаціях, часто вдається встановити порядок розташування сегментів у вихідній молекулі, тобто побудувати фізичну карту ДНК, де вказано положення кожного сегмента. Складні геноми або великі молекули ДНК дають при обробці рестріктірующімі ендонуклеаза складні набори фрагментів, і для їх аналізу використовують спеціальні комп'ютерні програми.

д. Захист ДНК за допомогою метилювання
Споріднені метилаза. Геноми бактерій, що кодують рестріктірующіе ендонуклеази, захищені від самодеградаціі за допомогою специфічних систем модифікації. Метилаза, здійснюють специфічну модифікацію, дізнаються ті ж нуклеорестрікціі в ДНК виявляють стійкість до дії певних ендонуклеаз. Наприклад, в ДНК хребетних часто зустрічаються дінуклеотід 5'-meCG-3 '. Якщо сайт рестрикції ендонуклеази Hpa II містить такий метильований дінуклеотід, то фермент не може розрізати ДНК в цьому місці. Цей факт використовується для визначення в складних геномах стану метилування таких динуклеотид 5'-CG-3 ', які знаходяться в сайтах впізнавання Hpa II. Незважаючи на нездатність ендонуклеази Hpa II розрізати дінуклеотід 5'-CmeCGG-3 ', її ізошізомер, ендонуклеаза Msp I, здійснює таке розрізання. Порівнюючи чутливість фрагментів ДНК до двох зазначених ферментам, можна локалізувати метильований цитозин на карті. Подібним же чином часто зустрічається в ДНК рослин послідовність 5'-СmеС T A GG-3 'можна відрізнити від Неметиловані форми, 5'-СС-3', якщо порівняти продукти, що виходять при розщепленні ДНК за допомогою ізо-шізомеров Bst NI і Eco RII.
Незалежні метилаза E. coli. При включенні фрагментів еукаріотичної ДНК в бактеріальні вектори та їх реплікації в клітинах Е. coli або інших прокаріот характерний для них тип метилювання втрачається і вони метіліруют способом, специфічним для нової клітини-господаря. Наприклад, в клітинах Е. coli дінуклеотід 5'-CG-3 'не метіліруют, і в результаті сайти, раніше захищені від дії ендонуклеази Hpa II, стають чутливими до неї. Проте два звичайних ферменту E. coli: dam ДНК-метилтрансферази, яка метіліруют залишок А в послідовності 5'-GATC-3 ', і dcm ДНК-метилтрансферази, метіліруют залишок С в послідовності 5'-СС-3', - утворюють нові стійкі сайти; жодна з цих метилаза не є частиною системи рестрикції-модифікації. Крім того, еукаріотична ДНК, репліковану в E. coli, стає стійкою до ендонуклеаза Mbo I і Bcl I завдяки тому, що в межах їхніх сайтів впізнавання знаходиться 6-метіладенін. Зауважимо, що той же самий 6-метіладенін в сайті 5'-GATC-3 "не заважає роботі ендонуклеаз Bam HI, Bgl I або Sau 3А; однак розрізання за допомогою Sau 3А блокується, якщо метиловано залишок С.
Фосфомоноестерази
Часто при проведенні експериментів з рекомбінантними ДНК або при аналізі структури ДНК доводиться відщеплювати кінцеві фосфомоноефірние групи. Відомо безліч неспецифічних фосфомоноестераз. Ці ферменти, виділені з клітин Є. coli і кишечника теляти, були отримані в високоочищеним вигляді. Фосфатази гідролізують як 5'-, так і 3'-кінцеві фосфомоноефіри в ДНК і РНК.
Фосфомоноефірние групи, що знаходяться на кінці одноланцюгових розривів в дуплексної ДНК або екрановані нависає над ними другим ланцюгом, подібні тим, які утворюються при розрізанні ендонуклеаз Pst I, видаляються за допомогою фосфатази тільки при слабоденатурірующіх умовах.
Полінуклеотідкіназа
Кінази становлять великий клас ферментів, що каталізують фосфорилювання багатьох біохімічних з'єднань - від невеликих молекул до дуже великих макромолекул, включаючи поліпептиди і полінуклеотиди.
Полінуклеотідкіназа, широко використовується як реактиву в експериментах з рекомбінантними ДНК, була виділена і очищена з клітин E. coli, інфікованих бактеріофагом Т4. Фермент кодується геномом бактеріофага. Донором фосфату служить АТР, а одним з продуктів реакції є ADP. У ході реакції специфічно фосфорилюються 5'-кінцеві гідроксильні групи молекул ДНК і РНК; 3'-кінцеві гідроксильні групи не фосфорилюються. Однією з важливих сфер застосування полінуклеотідкінази є мічення 5'-кінця полинуклеотидной ланцюга за допомогою радіоактивного 32 Р з використанням АТР, міченої по у-фосфату. Послідовне дію фосфатази і полінуклеотідкінази призводить до заміщення немічених 5'-кінцевого фосфомоноефіра на радіоактивний без будь-яких інших змін в ланцюзі.
ДНК-лігаза
Отримання рекомбінантних молекул ДНК включає об'єднання in vitro сегментів ДНК з різних джерел. Завдяки тому, що при розщепленні ДНК певними ендонуклеаза утворюються фрагменти з липкими кінцями, при відпалі ці фрагменти досить легко з'єднуються, проте водневі зв'язки, що утримують їх разом, в звичайних умовах виявляються відносно слабкими і легко руйнуються. Для ковалентного зшивання фрагментів використовують ДНК-лігази, яка каталізує утворення фосфодіефірних зв'язків між сусідніми нуклеотидами.
Щоб лігування було успішним, в об'єднуються ланцюгах повинен відбутися відпал комплементарних кінців; в цьому випадку відбувається лігування обох ланцюгів. Якщо два одноланцюгових сегмента утримуються поруч за рахунок утворення водневих зв'язків з інтактною комплементарної ланцюгом, то освіта фосфодіефірних зв'язку відбувається тільки в одного ланцюга. ДНК-лігаза фага Т4 здатна також з'єднати дволанцюжкові молекули з тупими кінцями, каталізує утворення фосфо-діефірних зв'язків в обох ланцюгах.
Ланцюги подовжуються шляхом послідовного приєднання нуклеотидів до праймеру з вільною 3'-гід-роксільной групою; вибір нуклеотидного залишку на кожному етапі визначається ДНК-матрицею. ДНК-полімераза I E. coli каталізує і деякі інші важливі реакції. Дві з них мають особливе значення для експериментів з рекомбінантними ДНК: це 3'-> 5'-і 5'-> 3'-екзонуклеазну реакції. В обох випадках утворюються продукти з 5'-фосфомоноефірнимі кінцями. Дві зазначені екзонуклеазну активності притаманні різним ділянкам молекули ДНК-полімерази I, які можна розділити, обробивши білок протеолітичними ферментами. Після поділу виявляється, що 3'-> 5'-екзонуклеазна і полімеразна активності пов'язані з великим за розміром поліпептидом, що містить карбоксильну групу на кінці, а 5'-> 3'-екзонуклеазна активність - з другим, більш дрібним фрагментом.
б. Ніктрансляція
Реакції, каталізуються ДНК-полімеразою I, знайшли широке застосування. Наприклад, часто використовується здатність ДНК-полімерази I каталізувати одночасно як полімеризацію, так і 5'-> 3'-екзонуклеазну розщеплення. Фермент, виступаючи в ролі екзонуклеазами, здійснює деградацію ланцюга в 5'-> 3'-напрямку, починаючи з 5'-кінця одноланцюжковою проломи в дволанцюжковій ДНК, а виступаючи в ролі полімерази, відновлює ланцюг шляхом послідовного приєднання мононуклеотідних залишків до вільної 3'- гідроксильної групи на іншому кінці проломи. Власне синтезу ДНК не відбувається: пролом лише переміщається вздовж ланцюга, чим і пояснюється назва цього процесу - ніктрансляція. Проводячи ніктрансляцію в присутності а-32 Р-мічених дезоксинуклеозидтрифосфатов, в якості субстратів отримують мічені фрагменти ДНК з високою питомою активністю.
в. Заповнення проломів
ДНК-полімераза здатна перетворювати фрагменти ДНК з липкими кінцями у фрагменти з тупими кінцями при наявності виступаючого 5'-кінця. 3'-гідроксильний кінець служить праймером, 5'-виступ - матрицею; пробіл на 3'-кінці заповнюється шляхом послідовного приєднання дезоксінуклеотідних залишків. Для заповнення краще використовувати великий карбоксіконцевой фрагмент ДНК-полімерази I, що отримується в результаті протеолізу; це дозволяє уникнути 5'-> 3'-екзонуклеазній розщеплення матриці. Липкі кінці можна перетворити на тупі і за допомогою специфічної до одноланцюжковою ДНК нуклеази, однак у цьому випадку втрачається кілька нуклеотидних залишків.
РНК-залежні ДНК-полімерази
Ці ферменти були виділені з РНК-вмісних опухолеродного вірусів. Вони дозволяють синтезувати ДНК на РНК-матриці in vitro. Реакція, що каталізується зворотними транскриптаза, аналогічна стандартним реакцій за участю ДНК-полімераз і, як у випадку з іншими ДНК-полімеразами, потребує затравки. В якості матриці зазвичай використовується один ланцюг РНК, на якій синтезується комплементарна ланцюг ДНК. У результаті утворюється гібридна молекула РНК-ДНК. Часто зручним праймером служить коротка ланцюжок полидезоксириботимидиловой кислоти, оскільки вона здатна спаровуватися з полірібоаде-Нілов кислотою, зазвичай знаходиться на кінцях еукаріотичних мРНК; в результаті такого парування ініціюється синтез ДНК-копії цієї РНК.
кДНК-копія молекули мРНК може бути перетворена в двухцепочечную ДНК. Для цього, перш за все, за допомогою РНКази Н або лужного гідролізу видаляють вихідну матричну РНК. Що Залишилося одноланцюжкова кДНК служить власним праймером при синтезі другий комплементарного ланцюжка ДНК. Як це відбувається, не зовсім ясно. Остання реакція може каталізувати або ДНК-полімеразою I, або зворотною транскриптазою. Мабуть, праймером служить коротка шпилькова структура, що утворюється поблизу 3'-гідроксильного кінця першої ланцюга. Кінцевий дуплекс все ще містить шпильку на одному з кінців, яка розрізає специфічною щодо одноланцюжковою ДНК нуклеаз з утворенням двох повністю комплементарних ланцюгів ДНК.
Термінальна дезоксинуклеотидил-трансфераза
а. Полімеризація без матриці
Термінальна дезоксинуклеотидилтрансфераза є в певному сенсі полімеразою, оскільки вона каталізує синтез полідезоксірібо-нуклеотидів з дезоксирибонуклеозидтрифосфатов з вивільненням неорганічного пірофосфату. Подібно ДНК-полімеразам, вона не здатна ініціювати синтез нової полімерної ланцюга і тому вимагає присутності праймера з вільною кінцевий 3'-гідроксильної групою. Однак на відміну від справжніх ДНК-полімераз вона не потребує в матриці і не здатна що-небудь копіювати взагалі. Продукт полімеризації відповідає дезокси-нуклеозидтрифосфат, використовуваним в якості субстрату. Якщо в реакції бере участь dATP, то продуктом є полідезоксіаденіловая кислота, що на 3'-кінці праймера; якщо використовується dGTP, то до праймеру виявляється приєднаної poly. Оскільки термінальна дезоксинуклеотидилтрансфераза не копіює матрицю, продуктом синтезу є одноланцюговий полімер. При використанні як праймера дволанцюжкової молекули на кожному кінці дуплексу утворюються однакові 3'-хвости. Насправді термінальна дезоксінуклеоті-ділтрансфераза воліє одноланцюгові, а не дволанцюжкові праймери. Якщо є повністю дволанцюжкової фрагмент ДНК, до якого потрібно приєднати одноланцюгові хвости, можна використовувати різні методи отримання одноланцюгових решт, здатних служити праймерами.

б. Синтез липких кінців
За допомогою дезоксинуклеотидилтрансферазы до молекул ДНК, які не мають липких кінців, можна приєднати такі кінці. Тупі кінці утворюються при механічному розриві великих молекул ДНК, при обробці ДНК за допомогою рестріктірующіх ендонуклеаз, що дають тупі кінці, або при дії неспецифічних ДНКаз. Наприклад, якщо до одного набору фрагментів ДНК приєднати poly, а до іншого - poly і змішати ці фрагменти, то відбудеться їх з'єднання один з одним. Прогалини, які утворюються з-за нерівної довжини poly-та ро1уА) - хвостів, можуть бути заповнені за допомогою ДНК-полімерази I, а кінці з'єднані ДНК-лігази. Такий підхід використовувався при конструюванні першого рекомбінантної молекули ДНК. І хоча відкриття рестріктірующіх ендонуклеаз сильно спростило процедуру отримання липких кінців при рекомбінації молекул ДНК in vitro, іноді для їх створення все ще використовується термінальна дезоксинуклеотидил-трансфераза.
РOLY-полімераза
Подібно термінальної дезоксинуклеотидил-трансферази, po1y-полімераза приєднує нуклеотидні залишки до 3'-кінця ланцюга без участі матриці. Однак po1y-полімераза виявляє специфічність щодо РНК. Праймером є полирибонуклеотидов, а субстратом - АТР. При цьому GTP, СТР, UTP або dATP не можуть замінити ATP. Po1y-полімераза виконує високоспеціалізовану і важливу функцію в експериментах з рекомбінантними ДНК: її використовують для приєднання po1y-решт до молекул РНК при синтезі кДНК.
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Контрольна робота | 58,8кб. | скачати

Схожі роботи:
Ферменти 3
Білки і ферменти
Іммобілізовані ферменти
Каталізатори і ферменти
Ферменти біологічної мембрани
Ферменти клінічної діагностики
Травні соки поняття про ферменти та їх значення
Хімічна структура біохімічні властивості і ферменти бактерій
Ферменти та білки живої клітини це молекулярні біологічні автомати з програмним управлінням
© Усі права захищені
написати до нас
Рейтинг@Mail.ru