Створення біологічного водія ритму серця

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.


Нажми чтобы узнать.
скачати

Майкл Розен (Michael R. Rosen), доктор медицини

За смертністю серцево-судинні захворювання, як і раніше займають провідне положення в світі. Одні з найпоширеніших серцевих патологій - аритмії, причинами яких можуть бути різні функціональні та органічні ураження міокарда (насамперед інфаркт, ішемічна хвороба, вроджені чи набуті вади серця тощо). У нормально працюючому серці ритмічні скорочення міокарда відбуваються під дією імпульсів, які спонтанно зароджуються в клітинах сино-атріального вузла (рис.1). Інакше він називається первинним водієм ритму, або пейсмекером (англ. pacemaker - задає ритм). Від нього порушення поширюється по передсердям, змушуючи їх синхронно скорочуватися і перекачувати кров у шлуночки, і доходить до атріо-вентрикулярного вузла. Далі електричний імпульс через пучок Гіса досягає його кінцевих розгалужень - волокон Пуркіньє - і викликає скорочення шлуночків, внаслідок чого кров інакше, з серця до органів і тканин організму.

Створення біологічного водія ритму серця

Рис.1. Схема розташування водія ритму і провідної системи в серце.

Якщо з тієї або іншої причини порушення сино-атріального вузла не виникає або не може перейти на передсердя, його роль виконують Пейсмекер другого порядку, локалізовані в передсерді або в атріо-вентрикулярної з'єднанні. При повній поперечній блокаді, коли проведення збудження від передсердь до шлуночків повністю порушено, включаються Пейсмекер, розташовані в провідній системі шлуночків. Якщо і цього не відбувається, то припинення кровообігу в результаті зупинки шлуночків може призвести до необоротного пошкодження мозку і навіть смерті.

При повному порушенні автоматизму серця збудливість міокарда все-таки зберігається протягом деякого часу, і тоді на допомогу приходять штучні водії ритму - кардіостимулятори. Хоча за майже півстолітнє використання (перший портативний водій серцевого ритму з батарейним харчуванням був розроблений в 1957 р.) електронні Пейсмекер проявили себе дуже добре, тим не менш у них є ряд недоліків. По-перше, вони не регулюють реакцію серцевого м'яза на фізичні і емоційні навантаження. По-друге, у випадку, коли, наприклад, хвора дитина, має значення маса кардіостимулятора і розміри його електродів, які часто не відповідають зростанню і розвитку пацієнта. По-третє, через локалізації пейсмекерного електрода в серці не завжди вдається домогтися оптимальної активації порушення та скорочення. По-четверте, штучні водії ритму періодично повинні тестуватися і вимагають заміни батарей кожні 5-10 років, тобто практично повторної операції. І нарешті, деякі прилади (у тому числі і медичні - наприклад, томографи) можуть впливати на роботу електронного пейсмекера.

Словом, як би не були хороші навіть найсучасніші кардіостимулятори, пошук альтернативи необхідний. Один із перспективних рішень - біологічний водій ритму, який може працювати необмежений час, відповідати на фізіологічні команди, змінюючи серцевий ритм залежно від умов і активуючи серце з урахуванням специфіки захворювання будь-якої людини. Активний розвиток в останнє десятиліття генної та клітинної терапії дозволяє сподіватися, що такий біологічний пейсмекер буде створений і в кардіології з'явиться новий спосіб лікування аритмій [1].

У всіх дослідженнях по створенню біологічних Пейсмекер застосовувалися два підходи: введення специфічних генів у складі плазмідних або вірусних векторів і використання різних типів стовбурових клітин. При плануванні робіт бралися до уваги такі характеристики сино-атріального вузла:

- Складові його клітини спеціалізовані, тобто призначені для ініціації серцевих скорочень [2];

- Спонтанна генерація імпульсів відповідає фізіологічним і емоційним потребами організму, що обумовлено взаємодією іонних каналів і насосів [3];

- Поширення імпульсів має бути оптимальним для активації скорочення.

При розробці стратегії досліджень враховувалася, що формування спонтанних імпульсів у сино-атріального вузлі відбувається в результаті активації спеціального струму If, канали якого відкриті більш сотні мілісекунд, а зміна цього струму в часі добре підлаштовує ритм серця [4, 5]. У пейсмекерного струм вносять вклад і вхідні (наприклад, INa), і виходять (IK) струми, а також їх взаємодію, при якому збільшення вхідного струму та / або зменшення виходить призводить до почастішання ритму серця [3, 6-10].

Генна терапія

Вплив на автоматизм серця симпатичної нервової системи, яке опосередковано дією її медіаторів (адреналіну і норадреналіну), добре вивчено. У зв'язку з цим перші роботи по створенню біологічних Пейсмекер були спрямовані на активацію b-адренорецепторів, що призводить до фосфорилювання мембранних білків та посиленню входять струмів. Дослідники сподівалися домогтися підвищення автоматизму серця в результаті введення в передсердя свині спеціально сконструйованого плазмідної вектора з геном, що кодує  2-адренорецептор [11, 12]. Дійсно, ритм передсердь став достовірно вище вихідного рівня. Здавалося, шлях до успіху прокладений, однак ефект тривав всього близько 24 год, і не було впевненості, що, продовжуючи дослідження в цьому напрямку, можна домогтися стійкої роботи водія ритму. Неясно було навіть, що в даному випадку відбулося - корекція існуючої пейсмекерного активності або формування нової.

Наступним кроком стали експерименти, в яких спробували впливати на виходить, гіперполярізуется струм IK [13, 14]. Для цих цілей використовували аденовірусні вектор зі вбудованим мутантну Kir 2.1, що кодує одну з білкових субодиниць калієвого каналу [13]. Цю генну конструкцію вводили в порожнину лівого шлуночка морської свинки, що призвело через 3-4 дні до придушення калієвого струму IK на 80%. Протягом цього часу спонтанний ритм реєструвався на електрокардіограмі, і потенціали дії кардіоміоцитів виявили його високий рівень. Головний недолік такого підходу полягає в тому, що придушення струму IK саме по собі могло стати причиною аритмії. До того ж неясно, який з вхідних струмів забезпечував пейсмекерного функцію серця в даному випадку, тому наслідки таких робіт непередбачувані [15].

Стратегія експериментів, проведених в нашій лабораторії, була спрямована на підвищення інтенсивності пейсмекерного струму If (або струму автоматизму), який в нормі генерується тільки в клітинах сино-атріального вузла. Цей змішаний струм (формується як іонами натрію, так і іонами калію) унікальний за своєю природою, так як це єдиний струм, який не збільшує тривалості потенціалу дії і регулюється автономною нервовою системою [16, 17]. Відомо також, що канали, проникні If, складаються з білків сімейства HCN (Hyperpolarization activated, Сyclic Nucleotide gated - активуються гіперполяризацією, а стан воріт - відкриття і закриття - залежить від циклічних нуклеотидів). Ген НСN2 вбудували в аденовірусні вектор і ввели в клітинну культуру, що призвело не тільки до підвищення If, а й значного збільшення кількості б'ються клітин [18]. Більш того, при впливі на них ізопротеренолом (синтетичним аналогом катехоламінів) ці клітини відповідали позитивним хронотропного ефектом (прискоренням серцевого ритму) і негативним хронотропного ефектом на ацетилхолін, як зазвичай і відбувається в здоровому організмі. Значить, ці клітини потенційно здатні відповідати на фізіологічні команди [19].

Експерименти продовжили на собаках, яким за допомогою катетера вводили в ліве передсердя аденовірусну конструкцію - AdHCN2 і AdGFP (GFP - green fluorescent protein - зелений флуоресціюючий білок, ген якого використовується для синтезу кольорової "мітки"). Потім стимуляцією блукаючого нерва (під наркозом) домоглися гноблення синусового ритму. Через чотири дні в області ін'єкції аденовірусу виник новий ритм, чого не відбувалося у контрольних тварин, яким вводили тільки AdGFP або фізіологічний розчин [20]. Більш того, в дезагрегірованних клітинах серцевого м'яза, отриманих з місця ін'єкції, виявлено пейсмекерного струм в 100 разів більшої щільності в порівнянні з нативними кардіоміоцитами.

Повторне введення AdHCN2 в шлуночкову провідну систему тих же собак через чотири-сім днів при пригніченні синусового ритму приводила до появи в місці ін'єкції сталого вислизає ритму - близько 60 ударів на хвилину, більш частого в порівнянні з контролем (рис.2) [21]. Підвищена експресія HCN2 підтверджена за допомогою імунохімічних і біофізичних методів [22].

Створення біологічного водія ритму серця

Рис.2. ЕКГ собак, яким вводили аденовірусні конструкції з геном GFP (верхня запис) і генами GFP і HCN2 [21].

До ін'єкції синусовий ритм у обох собак був приблизно однаковий. Після його гноблення, що було викликано стимуляцією блукаючого нерва (час стимуляції відзначено стрілками), виникав ідіовентрікулярний ритм, причому у тварини, яким вводили обидва гена, він був прискореним і виникав швидше в порівнянні з контролем. На збільшених фрагментах записів видно, що в першому випадку (AdGFP + AdHCN2) порушення зароджується в лівому шлуночку, а в другому (AdGFP) - у правому.

Безумовно, з усіх перерахованих підходів генної терапії обнадіюють тільки результати останнього, оскільки тільки в цьому випадку виникав стабільно вислизає ідіовентрікулярний (власне шлуночковий) ритм прийнятного фізіологічного рівня і отримані докази відповідей викликаного ритму на активацію автономних нервів та їх медіаторів. І все ж обрана стратегія викликає деякі сумніви, тому що після припинення синусового ритму і до появи идиовентрикулярного проходить від 5 до 30 с, що з клінічної точки зору неприпустимо. Неясно також, чи вдасться за допомогою ін'єкції аденовірусної конструкції домогтися тривалої активності або вона буде зберігатися лише дні або тижні. Сумніви викликані короткочасною експресією гена, що пов'язано з властивостями аденовірусу, в який його вбудовують. Справа в тому, що в ядрі клітини-мішені геном аденовірусу існує переважно в епісомальной формі, тобто у вигляді кільцевих позахромосомних молекул, які в кожному циклі ділення піддаються реплікації за допомогою ДНК-полімерази клітини. Вірусна ДНК може вбудовуватися в лінійній формі в геном інфікованої клітини, тим не менше число епісомальних копій вірусної ДНК буде значно більше, ніж інтегрованих, що активізує імунну систему і приведе до повернення перетвореної клітини в початковий стан. Крім того, аденовіруси - причина звичайної застуди, тому, можливо, деякі люди будуть вже мати достатньо високі рівні антитіл до аденовірусної капсиду (покриває білку), що ускладнить потрапляння AdHCN2 в клітку. Інші вірусні вектори, наприклад, РНК-ретровіруси, хоча і володіють деякими перевагами (ефективністю передачі, геномної інтеграцією, стійкою експресією) потенційно патогенні, оскільки мають онкогенними послідовностями.

Клітинна терапія

Відкриття здібності ембріональних стовбурових клітин трансформуватися щонайменше в 350 різних типів клітин послужило поштовхом до активного їх вивчення і відкрило перспективи їх використання в біології та медицині, в тому числі і кардіології. Проте треба навчитися ідентифікувати та виділяти клітини-попередники, які після диференціювання можуть стати клітинами необхідної лінії. Опубліковані в 1999 р. в "Science" результати експериментів Д. Томсона і Дж.Беккера, яким вдалося виділити людські ембріональні стовбурові клітини та отримати перші лінії спеціалізованих клітин, були визнані третім за важливістю подією (після відкриття подвійної спіралі ДНК і розшифровки генома людини) в біології минулого століття.

Коли з'ясувалося, що певні підтипи ембріональних стовбурових клітин генерують імпульси, схожі зі спонтанними імпульсами істинних водіїв ритму, спробували використовувати ці клітини в якості біологічних Пейсмекер [22]. Але і тут виникло чимало проблем.

По-перше, оскільки незрілі ембріональні стовбурові клітини після припинення диференціювання можуть втратити пейсмекерного характеристики, було б великим досягненням, якщо б вдалося зупиняли розвиток отриманих кардіоміоцитів на стадії сино-атріальний клітин.

По-друге, важливо з'ясувати, які канали визначають спонтанний ритм пересаджених клітин, і переконатися, що це саме ті канали, які забезпечують роботу справжніх водіїв ритму в серці людини. Крім того, треба знати, як створена конструкція буде відповідати на стимуляцію вегетативних нервів, тобто визначити чутливість нових кардіоміоцитів до автономних нервовим впливів. Ці питання виникли у зв'язку з потенційною аритмогенність створюваних водіїв ритму [23]. Відповівши на ці питання, можна зрозуміти: розвиток аритмії в даному випадку - артефакт (наприклад, слідство експериментальних маніпуляцій) або потенційно небезпечну властивість біологічних Пейсмекер, створених на основі ембріональних стовбурових клітин. І нарешті, не вирішена проблема імунної відповіді організму на присутність завершили диференціювання клітин. У цьому відношенні більш перспективні, на наш погляд, мезенхімальні стовбурові клітини, які, як і ембріональні, поліпотентних (тобто здатні диференціюватися в ряд клітинних ліній, включаючи клітини скелетних м'язів і клітини сполучної тканини), але при цьому, мабуть , володіють "иммунопривилегированностью" - на останніх стадіях розвитку не викликають істотного імунної відповіді [24].

Спочатку стовбурові клітини були виявлені в кістковому мозку дорослого організму (точніше, в мезенхімі, чи в стромі, кісткового мозку). Згодом виявилося, що вони присутні практично у всіх органах дорослих тварин і людини, тим не менш зазвичай їх виділяють з кісткового мозку. Таким чином, з'явилася приваблива перспектива: створення банку мезенхімальних стовбурових клітин для клітинної терапії різних патологій. У випадку, коли з яких-небудь причин не можна використовувати донорські стовбурові клітини, їх джерелом може служити власний кістковий мозок пацієнта. Проте до того як це буде введено в практику, необхідно більш ретельно вивчити біобезпека, зокрема "іммунопрівілегірованность", стовбурових клітин.

Ми розглядали мезенхімальні стовбурові клітини дорослої людини в якості основного експериментального матеріалу. Перш за все нас залучили стабільність клітинних ліній та їх низька антигенність. Однак мезенхімальні стовбурові клітини людини не здатні генерувати пейсмекерного струм If, тому необхідно було навантажити їх геном HCN2, який, нагадаю, відповідає за трансляцію синтезу білків, що формують і переносять If. Зроблено це було за допомогою методу електропорації: клітини помістили в пульсуюче електричне поле, завдяки чому тимчасово відкривалися пори в клітинній мембрані, через які міг проникнути вірусний переносник з вбудованим геном HCN2; при цьому ефективність зараження становила 35-45% [25].

Створення біологічного водія ритму серця

Рис.3. ЕКГ собаки через п'ять днів після імплантації мезенхімальних стовбурових клітин людини, містять гени GFP і HCN2, в епікардом її лівого шлуночка [26]. Зліва направо: синусовий ритм до і після початку стимуляції блукаючого нерва, ідіовентрікулярний ритм під час вагусной стимуляції і відновлення синусового ритму після припинення стимуляції блукаючого нерва.

Модифіковані людські стовбурові клітини з експресувати геном HCN2 були пересаджені в невелику область епікарда лівого шлуночка собак [25]. Через тиждень у них на тлі пригнічення ритму сино-атріального вузла розвинулися ритми вислизання з частотою 60 збуджень у хвилину (рис.3). Локалізація джерела ритму в місці імплантації стовбурових клітин визначалася за допомогою методу флуоресцентного оптичного картування *.

* "Оптичні вимірювання трансмембранного потенціалу були задумані американським дослідником Л. Коеном. Ідея заснована на властивостях спеціально синтезованих молекул-флуорофорів, які, зв'язавшись з клітинною мембраною, здатні поглинати і випромінювати світло з ефективністю, яка залежить від величини електричного поля, в якому знаходиться ця молекула. Таким чином, висвітливши серце, прокрашенние флуорофорів, можна оптично виміряти кінетику трансмембранного потенціалу щодо змін інтенсивності або довжини хвилі флуоресценції. Більш того, використовуючи сучасні методи двомірної реєстрації світла, можна складати карти зміни трансмембранного потенціалу на поверхні серця. Оптична природа вимірювань дозволяє змінювати просторове дозвіл картування сигналів шляхом простої заміни оптичного збільшення. В даний час картування трансмембранного потенціалу здійснюється в широкому діапазоні просторового масштабу: від одиничної клітини до цілого серця ". (Єфімов І.Р., Самбелашвілі А.Т., Нікольський В.М. / / Вісник аритмії. 2002. № 26. С.91-96.) - Прімеч.ред.

Гістологічні дослідження показали, що пересаджені в міокард собаки мезенхімальні стовбурові клітини людини сформували між собою і з шлуночковими миоцитами так звані щілинні контакти - канальні білки, які переносять електричний струм між сполученими клітинами (рис. 4) [26]. Отриманий пейсмекерного струм виявляв типові для нього властивості: активізувався при гіперполяризації клітини, відповідав на катехоламіни і ацетилхолін і блокувався цезієм [25].

Створення біологічного водія ритму серця

Рис. 4. Мікрофотографія гістологічного зрізу міокарда собаки, якій імплантували людські стовбурових клітин з експресувати геном HCN2 [26]. Білими стрілками показані щілинні контакти, які утворилися між стовбуровими клітинами, червоними - між стовбуровими клітинами і кардіоміоцитами, фіолетовою стрілкою зазначено місце проліферації стовбурових клітин (інтеркалярний, або вставний диск).

Отже, мезенхімальні стовбурові клітини дорослої людини, судячи з усього, можна використовувати в якості субстрату для формування сино-атріального вузла, що було підтверджено в експериментах на собаках. Але перш, ніж дійде черга до людини, належить зробити ще дуже багато чого. Наприклад, перевірити in situ чутливість біологічного водія ритму до автономним нервовим впливів, порівняти тривалість функції створеного біологічного пейсмекера і його ефективність з відповідними параметрами електрокардіостимулятора, перевірити на токсичність і тератогенність. Крім того, з'ясувати, затримаються чи використовувані генні конструкції і клітини саме там, куди їх ввели, або мігрують. Невідомо також, чи залишаться стовбурові клітини після трансплантації дискретними і / або диференціюються в інші клітинні типи, і чи не будуть вони відторгатися. І нарешті, треба усунути головний недолік біологічних Пейсмекер, що проявився як в експериментах з використанням аденовірусних конструкцій, так і стовбурових клітин, які несуть ген HCN2, - скоротити інтервал між зупинкою синусового ритму і до виникнення идиовентрикулярного (в ідеалі він повинен тривати одну-дві секунди) .

До тих пір, поки не вдасться відповісти на всі ці питання, рано говорити про практичне застосування біологічних водіїв ритму і відмовлятися від електронних Пейсмекер - головного досягнення 20-го сторіччя в лікуванні захворювань провідної системи серця. Проте є всі підстави сподіватися, що не за горами той час, коли за допомогою генної та клітинної терапії будуть вирішуватися багато проблем в різних областях медицини, і тільки наша уява може обмежити застосування цих методик.

Робота виконана за підтримки USPHS-NHLBI (проекти № HL-28958, HL-67101, HL-20559, GM-55263) і відзначена премією "Heritage", заснованої Американською асоціацією серця (American Heart Association).

Список літератури

1. Zivin A., Bardy GH Cardiac pacemakers / / Foundations of Cardiac Arrhythmias / Eds. PMSpooner, MRRosen. NY, 2001. P.571-598.

2. Hoffman BF, Cranefield PF Electrophysiology of the Heart. NY, 1960.

3. DiFrancesco D. / / J. Physiol. 1981. № 314. P.377-393.

4. DiFrancesco D. / / J. Physiol. 1982. № 329. P.485-507.

5. Brown HF, Kimura J., Noble D. / / Proc. R. Soc. Lond. B. 1984. № 222. P.329-347.

6. Hagiwara N., Irisawa H., Kameyama M. / / J. Physiol (Lond). 1988. № 395. P.233-253.

7. Hagiwara N., Irisawa H., Kasanuki H. / / J. Physiol (Lond). 1992. № 448. P.53-72.

8. Noma A., Irisawa H. / / Jpn J. Physiol. 1975. № 25. P.287-302.

9. Ono K., Ito H. / / Am. J. Physiol. 1995. № 269. P.H453-H462.

10. Li J., Qu J., Nathan RD / / Am. J. Physiol. 1997. № 273. P.H2481-H2489.

11. Edelberg JM, Aird WC, Rosenberg RD / / J. Clin. Invest. 1998. № 101. P.337-343.

12. Edelberg JM, Huang DT, Josephson ME, Rosenberg RD / / Heart. 2001. № 86. P.559-562.

13. Miake J., Marbбn E., Nuss HB / / Nature. 2002. № 419. P.132-133.

14. Miake J., Marbбn E., Nuss HB / / J. Clin. Invest. 2003. V.111. № 10. P.1529-1536.

15. Silva J., Rudy Y. / / Circ. Res. 2003. № 92. P.261-263.

16. Santoro B., Liu DT, Yao H. et al. / / Cell. 1998. № 93. P.1-20.

17. Ludwig A., Zong X., Jeglitsch M. et al. / / Nature. 1998. № 393. P.587-591.

18. Qu J., Barbuti A., Protas L. et al. / / Circ. Res. 2001. № 89. P.E8-E14.

19. Rosen MR, Brink PR, Cohen IS et al. / / Cardiovasc. Res. 2004. V.64. № 1. P.12-23.

20. Qu J., Plotnikov AN, Danilo P.Jr. et al. / / Circulation. 2003. № 107. P.1106-1109.

21. Plotnikov AN, Sosunov EA, Qu J. et al. / / Circulation. 2004. № 109. P.506-512.

22. Gepstein L. / / Circ. Res. 2002. № 91. P.866-876.

23. Zhang YM, Hartzell C., Narlow M. et al. / / Circulation. 2002. V.106. № 10. P.1294-1299.

24. Liechty KW, MacKenzie TC, Shaaban AF et al. / / Nat. Med. 2000. V.6. № 11. P.1282-1286.

25. Potapova I., Plotnikov A., Lu Z. et al. / / Circ. Res. 2004. V.94. № 7. P.952-959.

26. Valiunas V., Doronin S., Valiuniene L. et al. / / J. Physiol. 2004. V.555. № 3. P.617-626.


Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Медицина | Реферат
40.1кб. | скачати


Схожі роботи:
Порушення ритму серця
Порушення ритму серця 2
Порушення ритму серця у дітей
Історія хвороби ІХС порушення ритму серця
Предиктори порушень ритму серця у юнаків допризивного віку з пролапсом мітрального клапана
Правила безпеки водія
Особливості праці водія
Діастолічна функція серця у хворих на цукровий діабет 2 типу в поєднанні з ішемічною хворобою серця
Основи психофізіології праці водія його професійна надійність
© Усі права захищені
написати до нас