Реплікація збереження і модифікація геному

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

Зміст
Реплікація, зберігання та модифікація геному
1. Реплікація ДНК
а. Матрична функція ДНК при реплікації
б. Реплікація починається в певних точках
в. Реплікація ДНК напівконсервативному
р. Комплементарне копіювання підстав, перенесення дезоксинуклеотидов і лігування ДНК при реплікації
д. Ключові ферменти, які беруть участь у синтезі ДНК
е. Для реплікації необхідно розкручування спіралі
ж. Ініціація утворення нових ланцюгів ДНК і їх зростання в реплікативних вилках
з. Термінація реплікації ДНК і розбіжність дочірніх спіралей
2. Реплікація РНК з утворенням ДНК
а. Реплікація геномів ретровірусів
б. Деякі ДНК-віруси використовують для реплікації зворотну транскрипцію
3. Репарація ДНК
а. Репарація шляхом прямого відновлення вихідної структури
б. Репарація шляхом заміни модифікованих залишків
в. Значення репарації ДНК
4. Рекомбінація ДНК
а. Типи рекомбінації
б. Загальна рекомбінація між гомологічними молекулами ДНК
в. Ферменти, які беруть участь у загальній рекомбінації
р. Сайт-специфічна рекомбінація
5. Реплікація

Реплікація, зберігання та модифікація геному

Генетична програма клітинних організмів записана у нуклеотидної послідовності ДНК. Отже, для збереження унікальних властивостей організму необхідне точне відтворення цієї послідовності в кожному наступному поколінні. Є. coli, наприклад, повинна дуплицировать практично без помилок повний геном розміром 4 * 10 6 нуклеотидних пар при утворенні кожного наступного покоління, так само повинні бути скопійовані майже 4 * 10 9 пар основ в 23 парах хромосом людини при кожному акті поділу клітин.
Однією з чудових особливостей ДНК і те, що в ній закодована інформація про механізм її власного подвоєння: одні гени кодують ферменти, які синтезують нуклеотидні попередники ДНК, інші - білки, що здійснюють збірку активованих нуклеотидів в полінуклеотидні ланцюжка. Є гени, координуючі процес реплікації з іншими клітинними подіями, а також гени, що кодують білки, які упаковують ДНК в хроматин. Ще одним незвичайним властивістю ДНК і те, що вона служить матрицею і визначає порядок, в якому нуклеотиди шикуються в нові нуклеотидні ланцюжки. Володіючи однаковим апаратом синтезу, різні ДНК здійснюють освіту тільки подібних собі реплік.
У генетичній програмі передбачені ферментативний механізм, який виправляє помилки, іноді відбуваються при реплікації ДНК, і механізм репарації ушкоджень, які зачіпають підстави або спіральну структуру при опроміненні рентгенівськими променями і ультрафіолетовим світлом або при дії різних хімічних агентів, а також механізм усунення дефектів, пов'язаних з деякими захворюваннями. Генетична програма забезпечує створення геномних варіантів і можливість еволюційних змін. Певні гени кодують білки, які сприяють обміну ланцюгами, які належать різним молекулам ДНК, і тим самим створення нових комбінацій генетичного матеріалу, що передаються потомству. Відомі білки, що викликають геномні перебудови шляхом каталізу транслокацій невеликих сегментів або навіть протяжних ділянок в межах однієї молекули ДНК і між молекулами. З одного боку, рекомбінації і транслокації подібного роду створюють основу для еволюційних експериментів, а з іншого боку - деякі перебудови можуть бути причиною захворювань. Як це не дивно, оптимальне функціонування деяких генетичних програм дійсно залежить від специфічних перебудов в ДНК.

1. Реплікація ДНК

а. Матрична функція ДНК при реплікації

Оприлюднюючи свою модель структури ДНК в 1953 р., Джеймс Уотсон і Френсіс Крік писали: "Ми не могли не усвідомлювати, що специфічне спаровування, постулированное нами, передбачає наявність якогось механізму копіювання генетичного матеріалу". І через місяць вони поглибили цю думку: "Якщо відомий точний порядок підстав в одному з ланцюжків, то можна записати і порядок підстав в іншій, оскільки спаровування основ специфічно. Таким чином, один ланцюг є комплементом інший; саме це властивість наводить на думку, що ДНК може подвоювати саму себе ".
Уотсон і Крик припустили, що для подвоєння ДНК повинні відбутися розрив водневих зв'язків, що утримують разом спіральний дуплекс, і розбіжність ланцюгів. Вони також висловили думку, що кожне коло дуплексу служить матрицею при синтезі комплементарного ланцюжка і в результаті утворюються дві пари ланцюгів, в кожній з яких тільки одна є батьківської. Такий механізм точного відтворення послідовності нуклеотидних пар в подвійній спіралі. Уотсон і Крик вважали, що реплікація ДНК здійснюється спонтанно, без участі ферментів, але це виявилося не так. Тим не менше, ідея про те, що подвоєння ДНК відбувається шляхом послідовного з'єднання нуклеотидів у відповідності з правилом комплементарності, заданим кожної ланцюгом спіралі, дозволила концептуальну проблему точного відтворення генів.
З того часу, як було висловлено це припущення, матрична природа механізму реплікації була підтверджена численними даними, отриманими як in vivo, так і in vitro для різних організмів. Відповідно до моделі, реплікація всіх дволанцюжкові ДНК напівконсервативному. Чи існують в природі альтернативні способи реплікації дволанцюгової ДНК - невідомо. Отже, після одного раунду реплікації один ланцюг в кожній з двох дочірніх молекул є батьківської, тобто консервативною, а інша - синтезованою заново. Якщо геном представлений одноланцюжковою ДНК, то ця єдина ланцюг служить матрицею для утворення комплементарного ланцюжка, з якою вона утворює дуплекс, а потім на цьому дуплексі синтезуються або дочірні дуплекси, або одноланцюгові копії однієї з матричних ланцюгів.

б. Реплікація починається в певних точках

Початок реплікації. Реплікація ДНК починається не в будь-випадкової точці молекули, а в специфічних місцях, званих точками початку реплікації. Процес копіювання триває через освіту реплікативних вилок в одному або обох напрямах до тих пір, поки ДНК повністю не подвоїться. У замкнутих кільцевих дуплексу ДНК новосинтезовані ланцюга ковалентно з'єднуються в місцях зустрічі збільшуються в розмірі реплікативних вилок або в тому місці, де єдина вилка повертається до точки початку реплікації. Дочірні молекули, як правило, розходяться ще до початку нового раунду реплікації. Такі розрізняються за розміром геноми, як геном вірусу SV40, бактеріофага X і E. coli, відтворюються в результаті одного ініціюючого події, що відбувається в певній точці.
У про - та еукаріотів можна зустріти різні варіації на цю тему. Так, кожна з ланцюгів батьківського спіралі мітохондріальної ДНК тварин і ДНК плазміди Col E1 має свою точку початку реплікації. Синтез комплементарного ланцюжка деяких невеликих одноланцюгових фагових геномів починається поблизу однієї специфічної послідовності, а реплікація отриманого дуплексу може ініціюватися зовсім в іншій точці. Реплікація лінійних дуплексних ДНК також ініціюється в особливих сайтах. Наприклад, ДНК бактеріофага Т7 реплікується у двох протилежних напрямках до різних кінцях молекули, починаючи від однієї точки, а кожна з двох ланцюгів ДНК аденовірусу людини реплікується послідовно завжди від З "-кінця.
Для геномів еукаріотів зазвичай характерна наявність множинних точок початку реплікації, розкиданих по хромосомі на відстані 20 тощо н. Після ініціації реплікація продовжується в двох напрямках від кожної точки до тих пір, поки реплікативні вилки двох сусідніх точок початку реплікації не зіллються. Повнорозмірні ДНК кожної дочірньої хромосоми виходять шляхом з'єднання більш коротких, незалежно ініційованих новосинтезованих ланцюгів.
Швидкість реплікації генома. Швидкість реплікації генома регулюється в основному частотою ініціюючих подій. Так, у Є. coli швидкість копіювання в кожній реплікативної вилці постійна і дорівнює приблизно 1500 п. н. в секунду, отже, повний геном довжиною 4 * 10 6 пар реплікується приблизно за 40 хв. Якщо хромосома реплікується швидше, це означає, що збільшується частота актів ініціації в тій же самій точці початку реплікації при колишній швидкості копіювання. Клітини Є. coli діляться кожні 20 хв; це означає, що реплікація ДНК ініціюється в хромосомах, ще не закінчили попередній раунд реплікації. Швидкість руху реплікативної вилки в еукаріотичних клітинах значно менше, але завершення реплікації хромосоми в розумний час забезпечується одночасної ініціацією в безлічі точок. Отже, швидкість реплікації хромосом контролюється числом і розташуванням точок початку реплікації. Наприклад, в ранніх ембріонах дрозофіли реплікація хромосоми здійснюється кожні 3 хв завдяки майже одночасній ініціації подій у точках, віддалених один від одного на 7000-8000 п. н. У культурі клітин Drosophila спостерігається значно більш повільна швидкість дуплікації хромосоми, оскільки реплікація починається в набагато меншій кількості точок, що знаходяться один від одного на відстані 40000 п. н. Отже, при фіксованій швидкості росту ланцюга множинна ініціація забезпечує велику швидкість процесу і зменшує час, необхідний для дуплікації протяжних ділянок хромосом.
Структура точок початку реплікації. Фрагменти ДНК, що несуть точку початку реплікації, виділені з Є. coli і деяких коліфагів і плазмід, а також з дріжджів і ряду еукаріотичних вірусів. У деяких випадках місце початку реплікації має таку нуклеотидну послідовність, що дуплекс приймає незвичайну конфігурацію, яку розпізнають білки, що беруть участь в ініціації. Природа взаємодії між точкою початку реплікації і білками і механізм ініціації в цілому досліджені дуже мало, однак можна сказати, що, мабуть, вони в різних випадках різні.

в. Реплікація ДНК напівконсервативному

Після початку реплікації реплікативні вилки рухаються в одному або обох напрямках уздовж молекули ДНК. Чим далі просунулася вилка, тим довше новосинтезованих сегмент ДНК. Перш ніж обговорювати дані про механізми ініціації реплікативної вилки та її руху, отримані за допомогою модельних систем реплікації у прокаріотів, розглянемо основну реакцію, яка в реплікативної вилці в процесі копіювання дволанцюжкової ДНК.
Ланцюги ДНК синтезуються в результаті приєднання 5'-дезоксінуклеотідільних одиниць дезоксирибонуклеозидтрифосфатов до З "-гідроксильної кінця вже наявної ланцюга. Отже, вони синтезуються в напрямку 5'-> 3'вдоль матричної ланцюга, орієнтованої в протилежному, 3'-> 5 ', напрямку. Синтез ланцюгів у зворотному напрямі не відбувається ніколи, тому що синтезуються ланцюга в кожній реплікативної вилці повинні зростати в протилежних напрямках. Синтез одного ланцюга відбувається безперервно, а інший - імпульсами. Такий механізм реплікації називається напівбеззупинним. Провідна ланцюг зростає від 5 "- до 3'-кінця у напрямку руху реплікативної вилки і потребує тільки в одному акті ініціації. Зростання відстає ланцюга також йде від 5 "- до 3'-кінця, але в напрямку, протилежному руху реплікативної вилки. Для синтезу відстає ланцюга має відбутися кілька актів ініціації, в результаті чого утворюється безліч коротких ланцюгів. Ці ланцюги, звані фрагментами Окадзакі на честь відкрив їх вченого, мають розміри 1000-2000 нуклеотидів у прокаріотів і 100-200 на реплікується ДНК еукаріотів. У міру руху реплікативної вилки кінці сусідніх фрагментів Окадзакі з'єднуються з утворенням безперервної відстає ланцюга.
Механізми ініціації реплікації в точці початку реплікації і при утворенні фрагментів Окадзакі в відстає ланцюга в принципі аналогічні, хоча є деякі тонкі відмінності. В обох випадках відбувається утворення коротких РНК-запалів, комплементарних матричної ДНК, у вигляді продовження яких синтезується нова ланцюг ДНК. Надалі короткі вставки РНК заміщуються сегментами ДНК, які потім об'єднуються з утворенням безперервної відстає ланцюга.

р. Комплементарне копіювання підстав, перенесення дезоксинуклеотидов і лігування ДНК при реплікації

Нуклеотидна послідовність матричної ланцюга задає порядок розташування нуклеотидів в новосінтезіруемих ланцюгах ДНК. Незважаючи на те що правило комплементарності забезпечує більшу надійність процесу копіювання, останній небезошібочен. Через випадкових флуктуації в структурі приєднуються підстав і основ, що входять до складу матричної ланцюга, можуть відбуватися помилкове спаровування і включення неправильних нуклеотидів. При включенні неправильного нуклеотиду подальше зростання ланцюга зазвичай зупиняється. Ферменти, що каталізують приєднання нуклеотидів, володіють ефективною системою корекції - вони видаляють включений, але неспарений нуклеотид майже відразу після приєднання його до кінця зростання ланцюга. У загальному вигляді реакцію приєднання 5'-дезоксінуклеотідной групи до З "-ОН-групі кінцевого нуклеотиду праймерної ланцюга можна подати так:
"+ DNTP <=> m 1 + PP,
де dNMP-будь-який з чотирьох звичайних нуклеотидів. За один акт реплікації праймерних ланцюг подовжується на один залишок, при цьому одночасно відбувається видалення пірофосфату. Реакція приєднання нуклеотиду оборотна, але в цілому вона зміщена у бік синтезу, оскільки неорганічний фосфат в клітинах швидко руйнується. Ферменти, що каталізують праймер-залежну, детермініруемая ДНК-матрицею реакцію приєднання дезоксинуклеотидов, називаються ДНК-полімеразами. Багато ДНК-полімерази виділені і охарактеризовані.
Фрагменти Окадзакі, які утворюються при імпульсному копіюванні ланцюга ДНК, повинні згодом об'єднатися в безперервну відстаючу ланцюг. Ця реакція здійснюється ДНК-лігази - ферментів, які каталізують ковалентное зшивання ланцюгів ДНК в дуплексі; ДНК-лігази грають ключову роль не тільки в реплікації, а й у репарації пошкоджень і рекомбінації ДНК.

д. Ключові ферменти, які беруть участь у синтезі ДНК

Багато відомих тепер деталі процесу реплікації ДНК вдалося встановити завдяки дослідженням поведінки та активності ферментів, що забезпечують роботу апарату реплікації. Найбільш повно вивчено механізм реплікації бактеріальної ДНК, особливо ДНК Є. coli і бактеріофагів, які в ній розмножуються. Досить добре відомі і ферменти реплікації дріжджів, Drosophila, клітин і вірусів ссавців. Тут ми обговоримо механізм дії ДНК-полімераз і ДНК-лігази, оскільки при синтезі довгих ланцюгів ДНК ці два ферменти працюють злагоджено.
ДНК-полімерази. ДНК-полімерази присутні у всіх прокаріотичних та еукаріотичних клітинах. Більш того, багато вірусів бактерій і тварин індукують утворення вірус-специфічних ДНК-полімераз або білків, що сприяють ефективній участі ДНК-полімераз клітин-господарів у реплікації вірусної ДНК. Деякі прокаріотів і еукаріотичні ДНК-полімерази виділені в чистому вигляді, а їх фізичні та ферментативні властивості охарактеризовані. І хоча ці властивості не зовсім ідентичні, механізм каталізу для всіх зазначених ферментів в загальних рисах однаковий.
Найбільш повно вивчена ДНК-полімераза I E. coli. Вона являє собою одиночний поліпсптід з мультифункціональними активностями. Як ДНК-полімерази Pol I каталізує перенесення 5'-дезоксінуклеотідільних одиниць дезоксінуклеозід-5'-трифосфату до 3'-ОН-групі в ланцюзі ДНК або РНК, після чого відбувається спаровування перенесеного підстави з відповідним підставою комплементарного ланцюжка ДНК. Таким чином, для полімеризації ферменту необхідні праймер як дезоксінуклеотідного акцептора і матриця, що детермінує приєднання потрібного нук-леотіда. Крім полімеризації нуклеотидів, Pol I каталізує дві інші реакції, біологічна роль яких дуже важлива. В одній з них відбувається гідроліз фосфодіефірних зв'язків у одного ланцюга ДНК або на неспареним кінці дуплексної ДНК, причому за один акт видаляється один нуклеотид, починаючи з З "-кінця ланцюга. Друга реакція також полягає в відщепленні нуклеотидів, але гідроліз починається з 5'-кінця дуплексної ДНК у напрямку до 3'-кінця. Ці різні активності притаманні різним сайтам поліпептидного ланцюга Pol I. Якщо in vitro обробити Pol I трипсином, то поліпептидний ланцюг розщепиться на великий і малий фрагменти. Великий, С-кінцевий фрагмент зберігає ДНК-полімеразну і 3'-5'-екзонуклеазна активності; малий, N-кінцевий фрагмент володіє тільки 5-3'-екзонуклеазну активністю.
Pol I і властиві їй екзонуклеазну активності грають дуже велику роль у реплікації та репарації хромосомної ДНК E. coli.3 '-5'-екзонуклеазами-ва активність забезпечує контроль за приєднанням кожного нуклеотиду і видалення помилкових нуклеотидів з зростаючого кінця ланцюга. Якщо ця активність пригнічена в результаті якихось мутацій в гені, що кодує Pol I, то при реплікації генома часто відбуваються мутації - заміни підстав.
Здатність ДНК-полімерази подовжувати 3'-ко-нец ланцюга, спареної з матричною ланцюгом, дозволяє їй заповнювати прогалини між сегментами відстає ланцюга. Pol I подовжує фрагменти Окадзакі з 3'-решт і видаляє рибонуклеотиди, з яких починаються 5'-кінці сусідніх фрагментів, що є необхідною передумовою для формування безперервної відстає ланцюга. Оскільки Pol I здатна подовжувати 3'-кінець однієї з ланцюгів в місці розриву в дволанцюжковій ДНК і видаляти нуклеотиди, з 5'-кінця того ж розриву. цей фермент відіграє ключову роль у репарації пошкодженої ДНК. Нік-трансляція широко використовується in vitro для синтезу радіоактивно міченої ДНК.
У Е. coli є і два інші ДНК-полімерази, але вони присутні в клітці в менших кількостях. Pol II приєднує нуклеотиди значно менш ефективно, ніж Pol I, і не має 5-3'-ек-зонуклеазной активністю. Отже, Pol II може заповнювати прогалини між фрагментами ДНК, спареними з матричною ланцюгом, але не здатна відщеплювати РНК-нуклеотиди від фрагментів Окадзакі або здійснювати нік-трансляцію. Роль Pol II в реплікації і збереженні хромосомної ДНК E. coli до теперішнього моменту неясна.
Pol III-холоферменту - це ключовий фермент, відповідальний за реплікацію хромосомної ДНК E. coli. У кожній клітині міститься лише 10-20 копій Pol III-холоферменту, і тим не менше він є основним компонентом мультиферментного комплексу, ініціюючого формування реплікативних вилок в точках початку реплікації, що бере участь в елонгації лідируючої ланцюга в вилці і подовжуючого РНК-праймери з утворенням фрагментів Окадзакі . Але оскільки Pol III-xo-лофермент не має 5-3'-екзонуклеазну активністю, для реплікації відстає ланцюга необхідна участь Pol I, щоб відбулося подовження продукту, що утворився за участю Pol III, і видалення РНК-праймерів на 5'-кінці фрагментів Окадзакі.
Встановлені зміни в поліпептидного ланцюга основного ферменту Pol III, відомі амінокислотні заміни, які дозволяють приписати певні види ферментативної активності конкретним субодиниця ферментного комплексу. Так, а-субодиниця має полімеразної активністю, а Ј-субодиниця - 3'-5'-екзонуклеазну. Проте комплекс а - і Ј-субодиниць володіє значно більш високою полімеразної і екзонуклеазна активність, ніж кожна з відповідних субодиниць окремо. Функція третьої, 9-субодиниці поки неясна.
Крім субодиниць, що складають Pol III-кор, Pol III-холоферменту містить ще сім субодиниць: т, у, в, б, б ', х і р |). Перераховані поліпептиди також існують в безлічі копій, так що в результаті мовляв. маса комплексу становить приблизно 10 3 кДа. Роль в-субодиниці полягає в тому, щоб звести до мінімуму ймовірність відділення ферменту від матриці до завершення процесу копіювання; точна ж функція інших субодиниць невідома. Цілком можливо, що
Pol III-холоферменту існує у двох формах, кожна з яких містить певний набір допоміжних субодиниць, які надають ферменту певні властивості. В одній формі фермент каталізує синтез безперервної провідною ланцюга, а в іншій - переривчастою відстає.
Pol III-холоферменту каталізує ті ж реакції синтезу, що і Pol I, але працює приблизно в 60 разів швидше. Більш того, Pol III-холоферменту володіє підвищеним спорідненістю до матриці і забезпечує більш високу ефективність копіювання. Pol III-холоферменту може зв'язуватися і з іншими білками, збільшуючи ефективність процесу копіювання завдяки координації деяких важливих ферментативних етапів реплікації. На цьому більш високому рівні організації в комплекси можуть включатися білки, що розплітає спіраль ДНК у точках початку реплікації і в реплікативних вилках, які ініціюють утворення праймерних РНК, що забезпечують послідовне нарощування ланцюгів ДНК, терминируются процес реплікації і розділяють дочірні спіралі ДНК.
ДНК-полімерази, синтезовані іншими бактеріями і багатьма бактеріофагами, різняться за своїми фізичної структурі і властивостям. Тим не менш каталізуються ними реакції практично ідентичні реакціям, вивченим у Є. coli. У всіх ДНК-полімераз є коригувальна 3'-5'-екзо-Нуклеази, проте 5-3'-екзонуклеазами у деяких ферментів відсутня. Наприклад, ДНК-полімераза фага Т4 може здійснювати 3'-5'-екзонук-леазную реакцію корекції помилок, але не здатна каталізувати 5'-3'-екзонуклеазна реакцію і тому не може забезпечити нік-трансляцію. При реплікації ДНК фага Т4 5-3'-екзонуклеазна реакцію видалення РНК-праймерів перед об'єднанням фрагментів Окадзакі каталізує інший кодується фагом білок. У процесі переривчастого синтезу відстаючих ланцюгів і репарації пошкоджень ДНК фага Т4 цей фермент працює злагоджено з фагової ДНК-полімеразою.
В еукаріотичних клітинах ідентифіковано безліч ДНК-полімераз, але їх фізичні та функціональні властивості вивчені менш детально, ніж у відповідних ферментів прокаріотів. З клітин ссавців виділені чотири ДНК-полімерази: а, в б містяться в ядрах, а у - в мітохондріях. ДНК-полімераза а бере участь у реплікації хромосомної ДНК. Її полімеразна активність пов'язана з великим поліпептидом, але вона існує і, можливо, функціонує як муль-тісуб'едінічний білок, аналогічно Pol III-холоферменту E. coli. по-Полімераза - це поодинокий поліпептид, функцією якого є заповнення прогалин при репарації пошкоджень ДНК. Мітохондріальна полімераза у, що складається з чотирьох ідентичних поліпептидів, відповідальна за реплікацію мітохондріального геному. б-Полімераза схожа на полімеразу а за своїми молекулярним і синтетичним властивостям і також бере участь у реплікації хромосомної ДНК. Оскільки а-, в - та у-ДНК-полімерази ссавців позбавлені 3'-5 '- і 5-3'-екзонуклеазну активностей, властивих ферментам Є. coli, залишається неясно, як в процесі реплікації ДНК у цих організмів видаляються випадково включені помилкові нуклеотиди і РНК-затравки на кінцях фрагментів Окадзакі.
Деякі віруси тварин індукують синтез особливих полімераз для реплікації своїх геномів. Інші віруси утворюють білки, які стимулюють системи реплікації клітинної ДНК або беруть участь у реплікації вірусної ДНК. Наприклад, паповавірусах синтезують білки, необхідні для ініціації реплікації. Аденовіруси людини кодують білки, "запускають" ініціацію синтезу обох ланцюгів лінійної вірусної ДНК. Вони продукують також особлива ДНК-зв'язуючі білки, що полегшують реплікацію.
ДНК-лігази. ДНК-лігази необхідні для з'єднання ланцюгів ДНК при реплікації, репарації та рекомбінації. Всі відомі лігази здатні утворювати фосфодіефрние містки між 5'-фосфорильної і 3'-гідроксильної групами сусідніх дезоксинуклеотидов в місцях розривів ДНК. ДНК-лігаза, індукована в E. coli після зараження клітини фагом Т4, унікальна за своєю здатністю поєднувати дволанцюжкові фрагменти ДНК по кінцях розриву. Фізіологічна роль цієї реакції невідома, але практичне її значення в маніпуляціях із рекомбінантної ДНК неоціненне.
ДНК-лігази деяких бактерій, бактеріофагів і ссавців виділені і їх структура і механізм каталітичної активності встановлені. ДНК-лігази Є. coli, T4 і Т7-це поодинокі поліпептидні ланцюги, або АТР, або його похідного - нікотинамід-аденіндінуклеотіда. Реакція протікає в декілька етапів:
1) аденілільная одиниця NAD або АТР переноситься на Ј-аміногрупу лізінового залишку лігази з одночасним вивільненням нікотінамідмононуклеотіда або неорганічного фосфату відповідно;
2) аденілільная група переноситься від білка на 5'-фосфорильної групу кінцевого залишку ланцюга ДНК з утворенням пірофосфорільного похідного, аденіліл-ДНК;
3) аденілільная група, пов'язана з 5'-фосфорильної групою, заміщається 3'-гідроксильної групою прилеглого кінця ДНК. У результаті цих реакцій відбувається утворення фосфодіефірних зв'язків в ланцюзі ДНК за рахунок енергії гідролізу пірофосфорільной зв'язку NAD або АТР. Для утворення фосфодіефірних зв'язку у всіх випадках, крім лігази фага Т4, повинно відбутися з'єднання нуклеотиду, містить акцепторних 3'-гід-роксільную групу, з сусіднім нуклеотидом, що несе активовану 5'-фосфорильної групу. ДНК-лігази Є. coli і фага Т4 можуть з'єднувати кінці двох різних дуплексних фрагментів або розірвані кінці ланцюгів лінійної або кільцевої ДНК. Таким чином, за допомогою ДНК-лігази можуть утворюватися й лінійні, і кільцеві дуплексні молекули ДНК.

е. Для реплікації необхідно розкручування спіралі

Для здійснення комплементарного копіювання ланцюгів дволанцюжкова ДНК повинна поступово розкручуватися. Розкручування, або розплітання, спіралі відбувається тільки в локальній ділянці реплікативної вилки. Розплітання - це не спонтанний процес, у ньому беруть участь білки двох типів. Одні з них, звані ДНК-Геліка-ани використовують для розділення ланцюгів енергії, що вивільняється при гідролізі АТР до ADP. Геліказа часто функціонують у складі комплексу, що здійснює переміщення реплікативної вилки і реплікацію розплетених ланцюгів. Взагалі кажучи, для розплітання достатньо одного геліказного білка, але для того, щоб максимізувати швидкість розкручування, кілька геліказа можуть діяти спільно. Білки другого типу, що дестабілізують спіраль, - це білки, що зв'язуються з одноланцюжковий ділянками і тим самим стабілізуючі розплетених дуплекс. Отже, геліказа викликають локальне розкручування подвійної спіралі, а інші специфічні білки негайно зв'язуються з утворилися одноланцюжковий ділянками, забезпечуючи умови для комплементарного спаровування.
При реплікації хроматиновой ДНК еукаріотичних організмів виникають додаткові складнощі. Щоб розплести ДНК у складі хроматину, необхідно зруйнувати сильно конденсований комплекс гістонів і ДНК, а по завершенні реплікації знову упакувати дві дочірні спіралі в складні хроматіновие структури. Яким чином розкручуються еукаріотичні хромосоми при підготовці до реплікації? Про це відомо дуже мало. Розгорнуті, предсуществующие і нові нуклеосоми повинні асоціювати з синтезованою дуплексної ДНК. Щоб запобігти утворенню надто протяжних ділянок незв'язаної ДНК в період реплікації, збірка хроматину повинна відбуватися паралельно утворення дуплексної ДНК. Зв'язуються чи батьківські гістоновими октамер з однією або обома дочірніми спіралями - поки невідомо.
Топологічні проблеми розкручування і реплікації ДНК. Процес розкручування подвійної спіралі в реплікативної вилці породжує механічні та топологічні проблеми. У принципі розплітання лінійної дуплексної ДНК може відбуватися завдяки обертанню батьківського спіралі навколо власної осі. Однак обертання дуже довгих ланцюгів ДНК навколо довгих ж осей у внутрішньоклітинному просторі механічно утруднено. При реплікації замкнутих кільцевих ДНК розплітання ланцюгів у вилці створює додаткові проблеми. У міру розкручування ланцюгів ступінь негативної сверхспіральності сегментів, що знаходяться перед виделкою реплікації, поступово зменшується і в них виникає позитивна сверхспіралізація. Подальше переміщення вилки уздовж кільця ускладнюється і в кінці кінців блокується. Це блокування знімається шляхом внесення одноланцюжковою розриву. Тим самим утворюється "шарнір", який дає можливість нерепліцірованному дуплексу, що знаходиться перед виделкою, обертатися разом з нею. Такі розриви вносяться в ДНК за допомогою ферментів, що мають загальну назву ДНК-топоізомерази.
ДНК-топоізомерази. Ці ферменти змінюють ступінь сверхспіральності і тип сверхспіралі. Вони не тільки призводять до утворення шарніра, який створює умови для безперервного руху реплікативної вилки, але й забезпечують поділ або освіту катенанів - зчеплених кільцевих ДНК, а також усунення вузлів і поплутаних клубків з довгої лінійної ДНК. Топоізомерази є також невід'ємними учасниками деяких рекомбінаційних процесів.
У різних організмах ідентифіковані топоізомерази двох основних типів. Одні ферменти, звані топоізомеразами типу I, зменшують число сверхвітков в ДНК на одиницю за один акт. Ці топоізомерази надрізають одну з двох ланцюгів, в результаті чого фланкирующие дуплексні області можуть повернутися навколо інтактною ланцюга, і потім возз'єднують кінці розрізаної ланцюга. Ця реакція не потребує енергії АТР, оскільки енергія фосфодіефірних зв'язку зберігається завдяки тому, що тирозинових залишок у молекулі ферменту виступає то в ролі акцептора, то в ролі донора фосфорильного кінця розрізаної ланцюга. Одиночна ланцюг спонтанно проходить через розріз. Відзначено два цікавих, але, можливо, не пов'язаних один з одним відмінності між топоізомеразами типу I про - та еукаріотів:
1) топо-ізомерази типу I прокаріотів взаємодіють з 5'-фосфорильними кінцем розірваної ланцюга, а еу-каріота - з 3'-фосфорильними кінцем;
2) топоізомерази прокаріотів усувають тільки негативні сверхвіткі, а еукаріотичні - як негативні, так і позитивні.
Топоізомерази типу II усувають як негативні, так і позитивні сверхвіткі. На відміну від ферментів типу I топоізомерази типу II вносять тимчасові розриви в обидві комплементарні ланцюга, пропускають дволанцюжкової сегмент тієї ж самої або іншої молекули ДНК через розрив, а потім з'єднують розірвані кінці. Топоізомерази типу II теж використовують тирозинових залишки для зв'язування 5'-кінця кожної розірваної ланцюга в той час, коли інший дуплекс проходить через місце розриву.
У результаті внесення дволанцюжкової розриву і проходження через нього іншого дуплексу за один акт знімаються два негативних або позитивних сверхвітка. У деяких випадках дуплексом, що проходить через місце розриву, виявляється інша замкнута молекула ДНК; це призводить до поділу зчеплених кільцевих ДНК або, навпаки, до утворення таких зчеплених комплексів. Цей механізм може використовуватися і для розплутування або заплутування клубків, а також для розкручування або конденсації великих дуплексних ДНК.
Топоізомерази типів I і II знімають сверхвіткі, які утворюються при реплікації кільцевої ДНК.
Однак існує особлива топоізомераза II, звана гірази і виявлена ​​поки тільки у бактерій, яка індукує утворення негативних сверхвітков в релаксувати кільцевих ДНК. Для цього гіраза робить дволанцюжкові надрізи і потім особливим способом возз'єднує кінці. Отже, гіраза знімає позитивні сверхвіткі і вносить негативні в релаксувати ДНК. Збалансоване дію топоізомерази I і гірази - принаймні у бактерій - мабуть, регулює ступінь сверхспіральності ДНК і таким чином впливає на швидкість руху реплікативної вилки.
Механізм, за допомогою якого гіраза каталізує утворення негативних сверхвітков в кільцевій або іншої ДНК з топологічними обмеженнями, до кінця не встановлений. Гіраза Є. coli є тетрамер, що складається з субодиниць двох типів, при цьому а-субодиниці містять сайти ковалентного зв'язування кінців молекули ДНК. Гіраза каталізує утворення негативних сверхвітков, створюючи спочатку позитивні сверхвіткі в певних областях ДНК, пов'язаних з ферментом.
Орієнтація двох спіральних сегментів в цих областях змінюється на протилежну при протягуванні одного сегмента через "ворота", що утворилися в результаті дволанцюжкової розриву в іншому.
Врешті-решт утворюються два сверхвітка за один каталітичний цикл. Для реалізації всіх цих процесів необхідна енергія гідролізу АТР, оскільки релаксувати кільцева ДНК повинна бути переведена на більш високий енергетичний рівень, характерний для сверхспіральной конформації.

ж. Ініціація утворення нових ланцюгів ДНК і їх зростання в реплікативних вилках

Ініціація утворення нових ланцюгів ДНК. На відміну від РНК, синтез якої ініціюється РНК-репликазу і РНК-полімеразами, для ініціації синтезу ДНК потрібно затравка. Спочатку синтезуються короткі РНК-праймери, які потім нарощуються у вигляді ланцюгів ДНК. При перекладі кільцевої одно-цепочечной ДНК фага М13 в двухцепочечную реплікативну форму для синтезу коротких сегментів РНК в точці початку реплікації використовується РНК-полімераза-холоферменту. При реплікації інших одноланцюгових кільцевих фагових ДНК РНК-праймер синтезується спеціальної РНК-полімеразою, званої праймазою. У іншого фага з одноланцюжковою кільцевої ДНК мультиферментного комплекс, що містить від 15 до 20 поліпептидних ланцюгів, активує матричну ланцюг, в результаті чого праймазою синтезує РНК-затравки. Праймосомопраймазний спосіб ініціації застосовується і для ініціації синтезу провідною ланцюга в точці початку реплікації у Є. coli, а також при утворенні фрагментів Окадзакі при синтезі відстає ланцюга.
Мабуть, синтез ланцюгів ДНК ініціюється подібним чином у про - та еукаріотів, у разі плазмід і вірусів. Відмінності можуть стосуватися типів полімераз, що синтезують РНК-затравки, допоміжних білків, які забезпечують ініціацію РНК-транскриптів, і або нуклеотидних послідовностей per se, яких структурних особливостей, що визначають положення точки початку транскрипції. Довжина РНК-праймерів варіює залежно від особливостей ініціації. У бактеріофага фХ174 і Е. coli праймазою каталізує синтез РНК-праймерів довжиною від двох до п'яти нуклеотидів, а при реплікації ДНК еукаріотів праймерних РНК приблизно в два рази довше. У бактеріофагів М13 і G4 синтез РНК-запалів каталізують РНК-полімераза і G4-праймазою відповідно; довжина цих запалів коливається від 20 до 30 нуклеотидів, і вони комплементарні сегментами фагових ДНК, утворює петлі. Точна природа сигналів, що визначають сайти синтезу праймерної РНК для ініціації реплікації або для синтезу відстає ланцюга, невідома.
Реплікація плазмідної ДНК Col E1 також починається з транскрипції РНК. Однак у цьому випадку синтез праймерної РНК ініціюється РНК-полімеразою в сайті, віддаленому на 555 пар основ від точки початку реплікації плазмідної ДНК. Транскрипція проходить точку початку реплікації, при цьому синтезується ланцюг РНК довжиною 500-600 нуклеотидів. Потім РНКаза-Н розщеплює велику частину ланцюга РНК. Що залишається 3'-кінець РНК служить затравкою при синтезі ланцюга ДНК за допомогою Pol I-полімерази. Цей ланцюг стає провідною при реплікації всієї плазмідної ДНК.
У аденовірусів людини синтез нових ланцюгів ДНК ініціюється якимось білком, а не РНК. Аденовірус типу 2 містить білок з мовляв. масою 55 кДа, ковалентно зв'язаний з 5'-фос-фатом кожному ланцюзі ДНК. Перший етап ініціації синтезу нових ланцюгів полягає в тому, що кодується вірусом білок мовляв. масою 80 кДа зв'язується з дезоксинуклеозидтрифосфатом, відповідним перший дезоксінуклеотідному залишку в ДНК, з утворенням комплексу білок-dCMP. 3'-гідроксильна група пов'язаного з білком дезоксіцітідінового залишку служить праймером для подовження ланцюгів ДНК з використанням комплементарного ланцюжка ДНК в якості матриці. У кінцевому рахунку вірусний 80 кДа-білок відщеплюється і з новосинтезованих вірусної ДНК залишається зобов'язаним тільки термінальний білок мовляв. масою 55 кДа. Аналогічний механізм ініціації синтезу ДНК використовується і іншими аденовірусами та деякими бактеріофагами.
Одночасна реплікація обох ланцюгів в реплікативної вилки. Вивчення механізму реплікації фагової ДНК з використанням очищених ферментів з Є. coli дозволило побудувати вдосконалену модель напівконсервативної переривчастої реплікації ДНК в реплікативної вилки. Для розплітання спіралі при утворенні вилки необхідно, щоб в ДНК утворилися негативні сверхвіткі. Розплітання здійснюється АТР-залежної геліказа і полегшується в присутності білка, що зв'язується з одно-цепочечной ДНК. Після ініціації реплікації
Pol III-холоферменту подовжує лідируючу ланцюг ДНК до розмірів, рівних довжині хромосоми, шляхом послідовного приєднання до 3'-гідроксилу-ному кінця дезоксінуклеотідільних одиниць.
Синтез відстає ланцюга ініціюється прайм-сомо-праймазним комплексом. Прайм-сома, що володіє геліказной активністю, розплітає спіраль і, можливо, сприяє формуванню відповідних структур, що дозволяють асоційованої праймазою синтезувати праймер. Праймосомо-праймазний комплекс рухається в тому ж напрямку, що і вилка, зупиняючись тільки для того, щоб розплести дуплекс і синтезувати РНК-праймери. Ці короткі фрагменти РНК добудовуються потім Pol III-холоферменту шляхом додавання дезоксинуклеотидтрифосфатов з утворенням фрагментів Окадзакі довжиною від 1000 до 2000 нуклеотидів. Видалення сегментів РНК з 5'-кінця кожного фрагмента Окадзакі і заповнення прогалин між ними каталізується Pol I, здатної подовжувати ланцюга і здійснювати нік-трансляцію. Коли зростаючий 3'-гідроксильний кінець кожного фрагмента Окадзакі доходить до 5'-дезоксінуклео-тідного кінця сусіднього фрагмента, вступає в дію ДНК-лігаза і утворюється безперервна відстаюча ланцюг. Більш складна, але все ж гіпотетична модель руху реплікативної вилки передбачає формування бактерій реплісомою - мультиферментного комплексу більш високого рівня організації, що складається з функціонального праймосомо-праймазного комплексу, геліказа, Pol III-холоферменту і, можливо, гірази. Такий комплекс може забезпечувати подовження лідируючої ланцюга і одночасно ініціацію праймерної РНК, а також добудова ДНК при синтезі відстає ланцюга. Дві бактерій реплісомою, що працюють злагоджено в двох вилках реплікації, які рухаються в протилежних напрямках уздовж кільцевої хромосоми, зробили б цю модель ще більш витонченою.
ДНК. Субстратної матрицею в цьому випадку є дволанцюжкова кільцева ДНК, яка була реплікувати після перетворення на ранніх етапах інфекції лінійної вірусної ДНК в кільцеву реплікативну форму. Для того, щоб утворилася лінійна ДНК потомства, дволанцюжкові кільця надрізаються і асиметрично реплицируются, як це відбувається у випадку ДНК фагів М13 і фХ174. Однак відокремлюються поодинокі ланцюга перетворюються на дволанцюжкові структури. Спочатку в безлічі сайтів вздовж одиночної ланцюга праймазою синтезує короткі сегменти РНК. Потім ці сегменти добудовуються Pol III-холоферменту, прогалини заповнюються, РНК віддаляється за допомогою Pol I і нарешті короткі фрагменти ДНК з'єднуються ДНК-лігази. При упаковці ДНК в фаговой частки в спеціальних ділянках, званих cos-сайтами і віддалених один від одного на довжину вірусного генома, утворюються надрізи. У результаті довгі дуплекси багаторазово повтореної ДНК фага X розчленовуються на фрагменти, відповідні за розмірами зрілої ДНК, виявленої в вирионах.
Почергова реплікація ланцюгів. Реплікація ДНК аденовірусу відбувається без синтезу відстає ланцюга і тому без освіти множинних сайтів ініціації і фрагментів Окадзакі. Замість цього ланцюга лінійного дуплексного геному реплицируются поперемінно. Спочатку через освіту білкового праймера відбувається ініціація одного ланцюга, який безперервно подовжується аж до завершення реплікації. Відтіснила новосинтезованих ланцюгом, другий ланцюг дуплексу служить матрицею при синтезі таким же способом наступного дуплексу. З якого кінця батьківського дуплексу почнеться процес, мабуть, неважливо. Реплікація ДНК аденовірусу незвичайна в двох відносинах:
1) використання білка для запуску синтезу ланцюга ДНК з кінця лінійного дуплексу;
2) відсутність переривчастої реплікації, опосередковуваного РНК-транскрипт.

з. Термінація реплікації ДНК і розбіжність дочірніх спіралей

Термінація та розбіжності в кільцевих геномах. Замкнутість структури багатьох геномних ДНК спрощує завершення реплікації всієї нуклеотидної послідовності. Безперервне зростання провідною і відстає ланцюгів уздовж кільцевої матриці неминуче призводить до поєднання 3'-гідрокси - і 5-фосфорильного решт одного ланцюга або в точці початку реплікації, або - за двобічної реплікації - в середині кільця. Кільця в цих місцях зустрічі з'єднуються ДНК-лігази, при цьому зазвичай вони виявляються попарно зчепленими, і надалі має відбутися їх роз'єднання на окремі геноми. Це відбувається за допомогою топоізомерази типу II.
Термінація і завершення реплікації в лінійних ДНК. За винятком реплікації аденовірусної ДНК, де синтез нових ланцюгів ДНК ініціюється білковим праймером і матрична ланцюг копіюється цілком, у всіх інших випадках для реплікації необхідний РНК-праймер, що створює особливі проблеми при завершенні реплікації лінійної дуплексної ДНК. Справа в тому, що після ініціації синтезу нового ланцюга і подальшого видалення РНК-праймера новосинтезованих ланцюг містить пробіл на 5'-кінці. Оскільки ніяких способів подовження 5'-решт ланцюгів ДНК не існує, необхідні якісь інші методи завершення реплікації.
Були запропоновані два способи, за допомогою яких процес реплікації міг би завершуватися. Один з них передбачає, що існують ланцюга ДНК з прямими повторами на кінцях. Після реплікації два комплементарних кінця обох незавершених дуплексів можуть злучитися і утворити лінійні конкатемери з одноланцюжковий розривами. Залишаються прогалини можуть бути заповнені шляхом подовження ланцюгів у напрямі 3'-> 5 'з подальшим з'єднанням їх ДНК-лігази або шляхом прямого з'єднання стикуються решт за допомогою ДНК-лігази з утворенням конкатемеров. Після надрізання конкатемера специфічної ендонуклеаз утворюються виступаючі 5'-кінці, і ДНК-полімераза може нарощувати більш короткі ланцюги з 3'-кінця. Інший спосіб передбачає наявність на кінці кожної ланцюга ДНК коротких інвертованих повторів, завдяки яким утворюються невеликі петлі.3 '-кінець петлі служить праймером для копіювання нерепліцірованного ділянки. Завдяки специфічному розриву на початку інвертованого повтору виходить структура, яку можна добудувати за 3-кінця до відновлення вихідної дволанцюжкової кінцевий послідовності.
Нещодавно отримані дані свідчать про те, що кінцеві області еукаріотичних хромосом - теломери - реплицируются за допомогою особливого механізму, відмінного від представлених вище. Кінці хромосом дріжджів, безхребетних, рослин і хребетних мають схожу, вельми незвичайна будова: вони містять шпількообразние структури, в яких 3 '- і 5'-кінці дуплексу ДНК опиняються поруч, і багато коротких тандемних повторів. Близько петлі в одному з ланцюжків в області повторів є множинні одноланцюгові розриви. Питання про те, як подібна структурна організація може сприяти реплікації решт дуплексних ділянок, з'ясовується. Якщо врахувати подібність структурних особливостей кінцевих областей хромосом, то можна припустити, що механізм реплікації всіх еукаріотичних хромосом однаковий.

2. Реплікація РНК з утворенням ДНК

а. Реплікація геномів ретровірусів

Геном ретровірусів представлений єдиною молекулою одноланцюжковою РНК. Після проникнення РНК в клітину господаря вірусний геном піддається зворотної транскрипції, при цьому спочатку утворюється дуплекс РНК-ДНК, а потім дволанцюжкова ДНК. Ці етапи передують експресії вірусних генів на рівні білків і утворення РНК-геномів.
Фермент, що каталізує комплементарное копіювання РНК з утворенням ДНК, називається зворотним транскриптазою. Він міститься в ретровірусних частинках і активується після потрапляння вірусу в клітину та руйнації його ліпідно-глікопротеїновий оболонки. Цілком ймовірно, що зворотної транскрипції сприяють якісь допоміжні білки, які знаходяться всередині віріонів, оскільки в присутності останніх ферментативна реакція протікає набагато ефективніше і швидше, ніж у присутності очищеного ферменту. З'являється все більше даних про те, що зворотна транскрипція відбувається в самих різних еукаріотичних клітинах, а зворотна транскриптаза грає важливу роль у процесах перебудови генома
Зворотні транскриптази ретровірусів по суті є ДНК-полімеразами, і in vitro можуть використовувати в якості матриці ДНК. Однак набагато ефективніше вони працюють, якщо матрицею є РНК. Як і всі ДНК-полімерази, зворотні транскриптази не здатні ініціювати синтез нових ланцюгів ДНК. Але якщо синтез вже ініційований з допомогою праймерної РНК або 3'-кінцевий-го ділянки ДНК, то фермент ефективно здійснює синтез, використовуючи ланцюг ДНК як матрицю.
Ретровіруси - це диплоїдні організми, оскільки кожен віріон містить дві ідентичні ланцюга РНК розміром від 8000 до 10000 нуклеотидів. Ланцюги з'єднані поблизу своїх 5'-решт, однак природа цього нековалентно взаємодії невідома. Області 5 '- і 3'-кінців обох ланцюгів модифіковані, як і у всіх еукаріотичних мРНК. Розглядаючи механізм зворотної транскрипції, необхідно відзначити наявність п'яти структурних елементів у вірусної РНК:
1) прямі повтори на 5 '- і 3'-кінцях РНК;
2) послідовність з 80-120 нуклеотидів, що межує з 5'-кінцевим повтором;
3) послідовність з 170-1200 нуклеотидів, що межує з 3'-кінці-вим повтором;
4) послідовність з 15-20 нуклеотидів, в межах якої клітинна тРНК злучається з ретровірусної РНК, що створює праймер для синтезу першої ланцюга ДНК;
5) сегмент Рі, що знаходиться безпосередньо перед повтором U3 і є сайтом для праймування другий ланцюга ДНК; такий сегмент однаковий у РНК всіх ретровірусів певного типу.
Відомі три продукти, що утворюються в результаті зворотної транскрипції: форма А - лінійний дуплекс ДНК з послідовністю U3RU5, наявний на обох кінцях дуплексу; два кільцеві дуплексу ДНК, похідних форми А; форма В з LTR-повторами на обох кінцях і форма С тільки з одним LTR. Пояснити утворення структур А, В і С при зворотної транскрипції вірусної ДНК вельми непросто. Процес починається з нарощування тРНК-праймера на матрицях U5 і R в напрямку 3 '-> 5'. Потім РНКаза Н, специфічна до РНК у складі гібридного РНК-ДНК-дуплексу, розщеплює сегмент РНК цього дуплексу. Оскільки на 3'-кінці РНК є повтор R, новосинтезованих коротка ланцюг ДНК "перестрибує" на цей кінець молекули мРНК і злучається там з комплементарним їй ділянкою. Далі відбувається подовження ланцюжка ДНК з використанням в якості матриці решті частини мРНК. До моменту завершення синтезу першої ланцюга ДНК велика частина вірусної ДНК руйнується РНКази Н. Потім в передбачуваному сайті зв'язування праймера поблизу повтору U3 ініціюється синтез другого ланцюга ДНК з використанням новосинтезованих першому колі як матриці. Праймером для синтезу другий ланцюга може бути РНК, однак як іде синтез другого ланцюга - безперервно або переривчасто - невідомо. Після реплікації тРНК-зв'язує послідовності на 5'-кінці першому ланцюжку ДНК тРНК, мабуть, видаляється. Потім новосинтезованих другий ланцюг ДНК злучається з тРНК-зв'язує послідовністю першому ланцюжку. Після подовження 3'-кінців кожної ланцюга завершується освіту дуплексу ДНК. Зверніть увагу, що на кожному кінці ДНК-дуплексу є прямий повтор послідовності U3RU5 - LTR. Кільцеві ДНК, мабуть, утворюються або шляхом лігування кінців лінійної ДНК, або шляхом гомологічної рекомбінації між сегментами LTR. Дивно, що така складна послідовність реакцій протікає без явного участі ферментів реплікації клітини-господаря. Реплікація дволанцюжкової форми ретровірусної ДНК не починається до тих пір, поки вона не вбудується в клітинну ДНК. Субстратом для такого інтеграційного події є продукт зворотної транскрипції - лінійна дуплексний ДНК. Механізм рекомбінаційну вбудовування поки повністю не встановлений. У результаті інтеграції утворюється структура. При інтеграції на обох кінцях інтегрованої вірусної ДНК втрачається по декілька нуклеотидів в межах LTR-послідовностей і відбувається дуплікація 3-10 нуклеотидів клітинної ДНК. Після інтеграції ретровірусна ДНК реплікується як частина клітинної ДНК. РНК дочірніх віріонів утворюється в результаті транскрипції інтегрованих копій вірусної ДНК. Ініціація синтезу РНК відбувається в крайніх лівих точках стикування U3R, а термінація-в крайніх правих точках стикування RU5.

б. Деякі ДНК-віруси використовують для реплікації зворотну транскрипцію

Геном вірусу гепатиту В людини представлений кільцевої дволанцюжкової ДНК з пробілами. Якщо вірус знаходиться всередині клітини, то прогалини заповнюються віріонів ДНК-полімеразою. Така майже повнорозмірна ланцюг ДНК відіграє роль матриці, на якій синтезується РНК. Довжина цієї РНК дорівнює довжині геному вірусу, і вона грає роль мРНК в процесі експресії вірусних білків і роль матриці при зворотної транскрипції з утворенням дочірньої вірусної ДНК. Аналогічний механізм реалізується і при реплікації вірусу мозаїки цвітної капусти та інших вірусів рослин.

3. Репарація ДНК

ДНК - це єдина макромолекула клітини, яка здатна усувати пошкодження, що виникають у її структурі. Більш того, в ній закодована інформація про механізми найрізноманітніших репараційних процесів. Комплементарне спаровування лежить в основі не тільки реплікації ДНК, але і процесу відновлення вихідної структури ДНК при репарації ушкоджень, які зачіпають остов молекули, модифікацій того чи іншого підстави або помилкового спарювання при рекомбінації. Одночасне пошкодження обох кіл в одному місці і дволанцюжкові розриви часто виявляються летальними для ДНК, оскільки такі дефекти репаруючу лише в рідкісних випадках.
Найбільш часто відбувається розрив глікозидних зв'язків між пуринів і дезоксирибоза N при підвищенні температури. За добу в клітці людини відбувається від 5000 до 10000 актів депурінізаціі. Якщо не вживати ніяких заходів, то це призведе до порушення реплікації та експресії генів. Крім того, залишки цитозину і аденіну можуть піддаватися спонтанного дезамінування з утворенням відповідно залишків урацилу та гіпоксантину; частота таких подій складає приблизно 100 на геном на добу. Якщо подібні порушення в ДНК не будуть усунені до наступного раунду реплікації, то вони можуть послужити джерелом мутацій.
Багато змін в структурі ДНК відбуваються під дією хімічних речовин, присутніх в навколишньому середовищі. До таких речовин відносяться алкілуючі агенти, які модифікують переважно гуанінових залишки; з'єднання, вбудовується між сусідніми парами основ і що призводять до появи вставок і делецій під час реплікації; біфункціональність агенти, здатні утворювати ковалентні зшивки між двома ланцюгами ДНК і блокувати їх розбіжність при реплікації. Не менш руйнівними можуть бути і фізичні дії. Поглинання тимінових або цитозинових підставою ультрафіолетового світла може призводити до утворення ціклобутанових димерів між сусідніми піримі під дією іонізуючої радіації, наприклад космічних променів, можуть утворюватися високо реакційноздатні вільні радикали, які надають на ДНК найрізноманітніші впливу; при опроміненні рентгенівськими променями в медичних цілях у ДНК можуть виникати одне - і дволанцюжкові розриви, а також інші ушкодження, характерні для дії на ДНК вільних радикалів.
Як же ДНК протистоїть таким руйнівним діям? Завдяки яким механізмом відновлюється нормальна структура нуклеотидів і їх послідовність перш, ніж ефект впливу закріпиться і проявиться у вигляді мутації?
Відомі два основних типи репараційних процесів:
1) безпосереднє виправлення модифікацій або неправильних спаровувань, що не вимагає реплікації для відновлення вихідної структури;
2) видалення нуклеотидів, що оточують помилково спарені або змінені пари основ, і ре-синтез цієї ділянки шляхом реплікації.

а. Репарація шляхом прямого відновлення вихідної структури

Під дією алкилирующих агентів, наприклад N-метил-ГТГ-нітрозосечовини або Ч ^ ГЧ-діметілнітрозогуанідіна, в ДНК утворюються Про 6-метил - або Про 6-алкілзаміщених гуанінових залишки. Такі модифіковані залишки гуаніну можуть деалкіліроваться за участю ферментів, присутніх в клітинах бактерій та ссавців. Про 6-метилгуанін-ДНК-алкілтрансфераза каталізує перенесення алкільних груп на сульфгідрильні групи цистеїнових залишків ферменту, при цьому акцепторний білок інактивується. Зміст алкілтрансферази в клітинах Е. coli збільшується в присутності Про 6-алкілгуаніна, але в клітинах ссавців аналогічної індуцибельних не спостерігається.
При опроміненні ДНК ультрафіолетовим світлом в ній утворюються ціклобутановие димери між сусідніми піримідинових основ. Такі з'єднання блокують реплікацію ДНК, і для збереження життєздатності клітини їх необхідно видалити. Один із способів видалення піримідинових димерів полягає в ферментативному перетворенні їх на мономери при висвітленні розчину видимим світлом у діапазоні довжин хвиль 300-600 нм. Такі фотореактівірующіе ферменти є у бактерій і нижчих еукаріотичних організмів, але в клітинах ссавців вони не виявлені. Фермент утворює стабільний комплекс з пірімідіновим димером і, використовуючи енергію поглиненого ним світла, руйнує димер без розриву ланцюгів ДНК.

б. Репарація шляхом заміни модифікованих залишків

Заміна модифікованого нуклеотиду зазвичай відбувається в чотири етапи. По-перше, фермент розпізнає цей нуклеотид і надрізає полінуклеотидний ланцюг поблизу нього або розриває глікозидний зв'язок між модифікованим підставою і дезоксирибози. По-друге, екзонуклеазами видаляє модифікований нуклеотид та / або сусідні нуклеотиди, залишаючи невелику пролом. По-третє, віддалений ділянку синтезується заново з 3-ОН-кінця з використанням в якості матриці протилежної ланцюга. По-четверте, кінці розриву, що утворилися в результаті репарації, з'єднуються з відновленням ковалентного цілісності репарирувати ланцюга.
Сайти, у яких відбулася депурінізація або депірімідінізація, вищепляются ферментами, званими АР-ендонуклеази. У клітинах про - та еукарі - від є багато різноманітних АР-ендонуклеаз, часто по кілька різних типів. Деякі АР-ендонуклеази надрізають ланцюг з 3'-боку АР-сайту, а інші розщеплюють діефірную зв'язок з 3'-сто-рони; в будь-якому випадку утворюються 3'-гідроксильний і 5-фосфорильної кінці. Розрив фосфодіефірних зв'язку по один чи інший бік від місця порушення дозволяє екзонуклеазами видалити прилеглі залишки по обидві сторони сайту розщеплення і потім ресінтезіровать віддалену послідовність.
У репарації N-алкілованих пуринів та інших модифікованих підстав ключову роль грають специфічні N-глікозілази - ферменти, що розщеплюють глікозидний зв'язок між модифікованими підставами і дезоксирибози. N-глікозілази використовуються і при корекції порушень, які перебували у спонтанному дезаміні-рованії цитозину або аденіну та перетворення їх відповідно в урацил або гіпоксантин. Ферменти урацил-глікозілаза і гипоксантин-глікозілаза вищепляются з ДНК відповідно урацил і гипоксантин, залишаючи прогалини в місці відщепленні. І знову за допомогою механізму відщепленні-ресинтезу відновлюється вихідна послідовність пошкодженої ланцюга.
Урацил-глікозілаза грає дуже важливу роль антимутагенну і при виправленні помилок, що відбуваються при використанні під час реплікації dUTP замість dTTP. Оскільки спаровування dUMP з матрицею відбувається майже так само добре, як і dTMP, Pol III його не розпізнає, і якщо dUMP не піддається специфічному відщепленні, то при подальшому раунді реплікації в новий ланцюг може включитися dGMP. Таким чином, г-глікозілаза захищає клітини від можливих мутагенних наслідків включення в ланцюг ДНК dUMP.
Репарація тимінових димерів може відбуватися і в темряві одним з наступних двох способів. У клітинах Е. coli синтезуються три поліпептиду, які кодуються генами uvrA, uvrB і uvrC, які утворюють ферментний комплекс uvrЛВC-ендонуклеази. Цей фермент розрізає ланцюг ДНК, що містить піримідинових димер, на відстані восьми фосфодіефірних зв'язків з 5'-боку і чотирьох або п'яти зв'язків з 3'-боку піримідинового димеру. Видалення пошкодженої ділянки, мабуть, каталізується геліказа, що кодуються, ще одним геном, uvrD. У результаті видаляється тимінових димер і ще приблизно 12 оточуючих його нуклеотидів. Утворився прогалина заповнюється за допомогою Pol I, а ДНК-лігаза завершує репарацію, поєднуючи два сусідніх підстави ланцюга. Деякі організми використовують для репарації ушкоджень, що виникають при утворенні піримідинових димерів, інший механізм. Репарація здійснюється за участю піримідинових димер-г-глікозілази, яка створює апірімідіновий сайт. Глікозидного зв'язок між одним з тимін і дезоксирибози розрізається так, що тимінових димер залишається на 5'-кінці розірваної ланцюга, а 3'-ОН-група - на дезоксирибози. Утворився 3'-АР-кінець відщеплюється за допомогою 3'-5'-екзонуклеазну активності ДНК-полімерази, а потім шляхом нік-трансляції і лігування видаляється нуклеотид разом з прилеглих тимінових димером, заповнюється утворився прогалину і зшиваються кінці ланцюжка.

в. Значення репарації ДНК

У клітин в процесі еволюції виробився складний механізм усунення пошкоджень, що виникають в ДНК під дією найрізноманітніших хімічних і фізичних чинників, а також внаслідок помилок при реплікації або рекомбінації. І це цілком зрозуміло: велика частина пошкоджень блокує передачу генетичної інформації наступному поколінню, а інші, якщо їх не усунути, збережуться в геномах нащадків і призведуть до драматичних змін у молекулах білків, а тому числі і ферментів, необхідних для підтримання життєдіяльності клітини. При пошкодженні певних ланок системи репарації клітини стають особливо уразливими для деяких хімічних і фізичних агентів. Наприклад, клітини Є. coli, в яких порушена система внесення розривів в ДНК при відщепленні тимінових димерів, дуже чутливі до УФ-світла. Клітини, нездатні здійснити ту чи іншу N-глікозілазную реакцію, набагато більше, ніж нормальні, схильні до мутагенного або летального ефекту алкилирующих агентів або іонізуючої радіації. У клітин Є. coli, дефектних за Pol I, істотно знижена виживаність при опроміненні низькими дозами УФ-світла.
У представника нижчих еукаріот Saccharomyces cerevisiae є принаймні п'ять генів, що кодують білки, які беруть участь у внесенні розривів в УФ-опромінену ДНК. Порушення тільки в одному з цих п'яти RAD-генів призводить до того, що клітини втрачають здатність до внесення розривів в ДНК і, отже, до видалення піримідинових димерів. У дріжджів існують також мутанти з порушеною здатністю до видалення зшивок між ланцюгами, хоча елімінація УФ-індукованих ушкоджень проходить нормально. Це передбачає, що у дріжджів, як і у людини, для видалення поперечних зшивок, а можливо, і для виправлення безлічі інших хімічних модифікацій в ДНК існують специфічні, вельми складні механізми репарації.
Люди, які страждають пігментного ксеродерма, дуже чутливі до ультрафіолетового світла, і у них розвиваються різні форми раку шкіри навіть при дуже слабкому впливі сонячного світла. Клітини таких людей несуть мутацію, схожу з RAD-мутацією дріжджів і яка виявляється в тому, що у них порушена здатність до відщепленні піримідинових димерів з УФ-опроміненої ДНК. Захворювання може бути обумовлено мутацією в одному з принаймні дев'яти генів, що свідчить про досить складному механізмі репарації ДНК, що містить тимінових димери, у людини. Як правило, захворювання буває пов'язано з нездатністю до відщепленні тимінових димерів. Якщо до опроміненим клітинам в культурі додати фермент, що володіє тіміндімерглікозілазной і АР-ендонуклеазною активностями, то УФ-пошкодження можуть бути усунені.

4. Рекомбінація ДНК

Генетична рекомбінація включає кілька пов'язаних між собою процесів, в результаті яких у клітках або організмах, де вони відбуваються, створюються нові комбінації елементів носіїв генетичної інформації. Рекомбінація між близько розташованими гомологічними хромосомами призводить до інтенсивної перетасування батьківських і материнських генів в ході мейозу і тим самим створює передумови для еволюційної перевірки нових комбінацій цих генів у потомстві. Як правило, рекомбінаційні події, що відбуваються в соматичних клітинах або під час реплікації ДНК, або після неї і які у вигляді обміну сестринських хроматид, не призводять до зміни генотипу або фенотипу клітини. Однак нерідко вони породжують різні геномні перебудови. Це, наприклад, втрата, придбання або ампліфікація генетичних елементів і встановлення нових взаємозв'язків між уже наявними, але по-новому розташованими елементами.
Якщо використовувати молекулярні терміни, то можна сказати, що генетична рекомбінація полягає в утворенні ковалентних зв'язків між нуклеотидними послідовностями з різних областей однієї і тієї ж чи різних молекул ДНК.
Всі клітки і багато віруси містять інформацію про синтез ферментів, призначених не тільки для репарації пошкоджень у власній ДНК, але і ферментів, що здійснюють рекомбінацію. Насправді деякі ферменти, які беруть участь у реплікації та репарації ДНК, грають ключову роль і при рекомбінації. У цьому розділі ми розглянемо механізми деяких рекомбінаційних процесів і ферменти, які їх каталізують. Особливу увагу буде звернуто на рекомбінацію у бактерій і фагів, оскільки у них ці процеси доволі добре вивчені. Незважаючи на те що генетичні та морфологічні аспекти рекомбінації в еукаріотичних клітинах відомі, на молекулярному рівні тут багато чого залишається незрозумілим.

а. Типи рекомбінації

Існують три типи рекомбінації: загальна, або гомологичная, сайт-специфічна і випадкова, або негомологичностью.
Загальна рекомбінація. Загальна рекомбінація відбувається, як правило, між протяжними ділянками ідентичних або гомологічних нуклеотидних послідовностей. Її часто називають гомологічною рекомбінацією або кросинговером. При загальній рекомбінації відбувається розрив двох гомологічних ділянок ДНК, і кожен з кінців одного сегмента з'єднується з відповідними кінцями іншого таким чином, що обидві утворюються молекули містять різні фрагменти обох беруть участь в рекомбінації ДНК. Насправді сайти, за якими відбуваються розрив і возз'єднання кожної з двох ланцюгів, дуже часто не збігаються.
Звичайно загальна рекомбінація відбувається між гомологічними і алельними ділянками різних молекул ДНК, але вона може відбутися і між гомологічними, але неалельних областями ре-комбінує молекул. У цьому випадку один з продуктів рекомбінації втрачає частину ДНК, а інший набуває "зайвий" сегмент. Такий процес отримав назву нерівного кросинговеру. Іноді рекомбінація відбувається між неалельних ділянками однієї і тієї ж хромосоми з відповідною втратою області, що лежить між сайтами рекомбінації. На відміну від уже розглянутих випадків деякі рекомбінаційні події нереціпрокни; як наслідок, один з утворених продуктів ідентичний однієї з вихідних молекул, а інший відрізняється від обох партнерів. Такий процес часто називається генної конверсією.
Сайт-специфічна рекомбінація. Рекомбінація називається сайт-специфічної, якщо сайти розриву і возз'єднання у двох рекомбінує молекулах або двох фрагментах однієї і тієї ж молекули ДНК знаходяться в межах досить коротких специфічних гомологічних нуклеотидних послідовностей - як правило, не більше 25 нуклеотидів. Такі короткі послідовності може мати тільки один з партнерів або обидва. Як приклад першого варіанту можна привести транспозиції деяких мобільних елементів у еу - і прокаріот, а другого - процес інтеграції-відщепленні ДНК фага X з хромосоми Є. coli. За допомогою сайт-специфічної рекомбінації відбуваються запрограмовані перебудови хромосомної ДНК при зміні типів спаровування у дріжджів; вона відповідальна також за розмаїтість антитіл. Мабуть, загальна рекомбінація між якими парами гомологічних послідовностей здійснюється за допомогою одного і того ж комплексу ферментів, з іншого боку, для кожного випадку сайт-специфічної рекомбінації необхідний свій набір ферментів. Негомологичностью рекомбінація. Рекомбінація між негомологичностью нуклеотидними послідовностями відбувається в клітинах прокаріотів і дріжджів досить рідко, а в клітинах ссавців - досить часто. До негомологичностью рекомбінації можна віднести процес випадкового вбудовування вірусної або плазмідної ДНК у ДНК клітин тварин, в результаті чого в реплицируются геномах паповавирусов з'являється безліч делеції або дуплікацій. Кінці розірваної ДНК можуть з'єднатися, навіть якщо вони негомологичностью. У деяких випадках рекомбінація відбувається між послідовностями, що містять кілька гомологічних пар основ, або між короткими частково гомологічними ділянками. Але, як правило, рекомбінує сегменти не мають гомологічних послідовностей.

б. Загальна рекомбінація між гомологічними молекулами ДНК

Загальна рекомбінація при узгодженому внесення розривів і возз'єднання ланцюгів двох спіралей ДНК з утворенням протяжних гетеродуплексних областей. Щоб могла відбутися рекомбінація між подвійними спіралями, кожна з чотирьох ланцюгів повинна бути розірвана й потім з'єднана з новим партнером. Відповідні ланцюга обох лінійних гомологічних дуплексів ДНК надрізаються і вільні кінці однієї спіралі спаровуються з комплементарними ділянками інший. Перехрест стабілізується зшиванням кінців донорних ланцюгів з вільними кінцями реципієнтного спіралей. Точка перекреста обмінюються ланцюгів переміщається уздовж спіралей - процес, званий міграцією гілки. При цьому відбувається одночасне розбіжність ланцюгів вихідних спіралей та їх реассоціація з новими партнерами з утворенням дочірніх дуплексів. Структури Дие, а також ж називаються структурами Холлідея на ім'я дослідника, вперше їх запропонував.
Структури Холлідея можуть переходити в рекомбінантні подвійні спіралі шляхом внесення розриву і возз'єднання ланцюгів двома альтернативними способами. Один спосіб полягає в розрізанні і возз'єднання перехрещуються ланцюгів. Два реципрокних продукту л і м можуть утворитися, якщо розрив і подальше возз'єднання ланцюгів відбудуться в точці перехрещення в структурах е і д або по лінії перетину чотирьох ланцюгів в ізомерної структурі Холлідея і. Розмір обмінюються фрагментів залежить від відстані, на яку відбулася міграція гілки до акту рекомбінації. Альтернативні продукти н і про утворюються в тому випадку, якщо структура Холлідея з переходить в результаті розриву в к.
В основі рекомбінації даного типу лежить гомологічні спаровування ланцюгів, що належать двом різним спіралях ДНК, тому швидше за все вона відбудеться в тому місці, де таке спаровування можливо a priori і де гомологічного послідовностей досить велика, щоб могла статися міграція гілки в рамках структури зі схрестившись ланцюгами. Звідси можна зрозуміти, чому загальна, або гомологичная, рекомбінація відбувається також між двома повторами в межах однієї молекули ДНК або між алельними і неалельних елементами однієї і тієї ж послідовності у двох різних хромосомах.
У ході міграції галузі при паруванні ланцюгів, що належать різним спіралях, утворюються гетеродуплекси. У таких гетеродуплексах в межах сегмента між сайтом початку утворення структури Холідея і сайтом кросинговеру може міститися по одному чи більше помилково спарених підстав. Вони віддаляються так само, як будь-які модифіковані основи при репарації ДНК. Однак, оскільки видалено може бути будь-яке з помилково спарених підстав, в обох рекомбінантних спіралях в даному сайті можуть виявитися однакові пари основ, тобто рекомбінація для цього сайту виявиться нереціпрокной. Таким чином, кожна з рекомбінантних спіралей може бути схожа на будь-який з початкових дуплексів у тих позиціях, де початково вони розрізнялися.
Загальна рекомбінація з утворенням дволанцюжкової розриву. Альтернативний механізм спільної рекомбінації включає освіту дволанцюжкової розриву в одному з дуплексів-партнерів. Далі за допомогою екзонуклеазами в місці розриву утворюється пролом. При паруванні 3'-одноланцюжковою кінця проломи з комплементарною ланцюгом інтактною спіралі в останній утворюється петля. Розмір цієї петлі збільшується у міру того, як ДНК-полімераза нарощує 3'-кінець "вклинилися" ланцюга. У підсумку другий одноланцюговий кінець проломи злучається з комплементарною послідовністю в переміщається петлі. У результаті такого парування утворюється система "праймер-матриця", і ДНК-полімераза синтезує відсутню ланцюг, заповнюючи пролом. Лігированіє двох зростаючих кінців з вихідними ланцюгами призводить до утворення подвійної структури Холідея. Міграція гілки в одному або обох перекреста пересуває обидва місця зчеплення в будь-якому напрямку, при цьому в ділянках, що фланкують пролом, можуть виникати помилки. Поділ таких структур може йти двома способами - з перекрестом і без нього, з утворенням чотирьох дуплексів.
Необхідно відзначити деякі особливості цього механізму. Освіта помилкових пар в районах, що фланкують пролом, зумовлює набуття як реципрокних, так і нереціпрокних рекомбінацій між генетичними маркерами. Якщо дволанцюжкової розрив відбувається поблизу ділянки, де між спіралями є відмінності, то рекомбінантів успадкують нуклеотидну послідовність партнера, у якого розриву не відбувалося. Цей механізм пояснює багато випадків генної конверсії, особливо ті, в яких протяжна послідовність одного дуплексу заміщається відповідною, але відрізняється послідовністю іншого дуплексу.
Нереціпрокная загальна рекомбінація використовується і при репарації деяких пошкоджень ДНК. Наприклад, якщо тимінових димери не були видалені з УФ-опроміненої ДНК до того, як до них підійшла репликативная вилка, то синтез комплементарного ланцюжка в цій ділянці не може бути завершений. Оскільки тимінових димери, що є навпроти проломи, не можуть бути вищеплени, залишається один шлях для порятунку хроматиди - використовувати генетичну інформацію гомологічною сестринської хроматиди заповнити пролом. Для цього застосовується такий же механізм, як для репарації проломів.

в. Ферменти, які беруть участь у загальній рекомбінації

У загальній рекомбінації беруть участь два специфічних ферменту і ще кілька ферментів, що каталізують також процеси реплікації та репарації ДНК. Ензимологія загальної рекомбінації вивчена тільки для деяких прокаріотів, зокрема E. coli та її фагів. Один зі специфічних ферментів, необхідних для успішної гомологічною рекомбінації, називається recA-білком. Він каталізує обмін одиночними ланцюгами, використовуючи енергію гідролізу АТР до ADP і неорганічного фосфату. RecA-залежне впровадження одноланцюгових ДНК в дуплекс - перший етап рекомбінаційні процеси в рамках обох схем Холлідея та механізму з утворенням дволанцюжкові розривів. Другий фермент, що складається з трьох окремих субодиниць і тому званий recBCD-нуклеаз, володіє ендо - і екзонуклеазну, а також геліказной активностями. Механізм його дії до кінця не встановлений, однак відомо, що recBCD-Нуклеази індукує розриви в дуплексної ДНК і завдяки притаманній їй геліказной активності разом з recA ініціює рекомбінаційний процес. Ідентифіковано також фермент, розрізає вузли в структурах Холлідея; за його участю утворюються липкі кінці, що з'єднуються лігази.
У загальній рекомбінації беруть участь також геліказа і білки, що зв'язуються з одноланцюжковою ДНК; обидва вони необхідні для забезпечення процесу міграції гілки. Як відомо, переміщенню ланцюгів під час міграції гілки сприяє Pol I, а в возз'єднання розірваних ланцюгів бере участь ДНК-лігаза. Для зняття топологічних обмежень при розкручуванні спіралі і для розплутування перекручених структур, мабуть, потрібні топоізомераза типу I і, можливо, гіраза.

р. Сайт-специфічна рекомбінація

Сайт-специфічна рекомбінація відбувається між специфічними сегментами дуплексів ДНК, що не мають протяжних гомологічних ділянок. Характерним прикладом такої рекомбінації служить інтеграція кільцевої ДНК фага X з хромосомою Є. coli та її зворотне відщепленні. Незважаючи на те що ці рекомбінаційні події також включають розрив і возз'єднання двох спіральних сегментів ДНК, їх механізм абсолютно відмінний від механізму загальної рекомбінації. У цьому випадку рекомбінація відбувається в межах специфічної нуклеотидної послідовності ДНК фага X і унікальної послідовності ДНК Є. coli. Нуклеотидні послідовності attP - і attВ-сайтів зовсім різні, хоча мають загальне ядро ​​протяжністю в 15 нуклеотидних пар. AttP простягається на 150 нуклеотидів вліво і на 75 нуклеотидів вправо від загального ядра, a attB - це сегмент довжиною всього близько 25 нуклеотидів, включаючи і ядро. Рекомбінаційні події, що відбуваються як при інтеграції, так і при виключенні ДНК фага X з хромосоми Є. coli.
Оскільки нуклеотидні послідовності, фланкирующие attP - і а?? По-сайти ліворуч і праворуч, для цих сайтів розрізняються, механізм рекомбінаційну відщепленні ДНК фага X з ДНК Є. coli повинен відрізнятися від механізму їх рекомбинационной інтеграції. І дійсно, для рекомбінації між attL і attR при виключенні фагової ДНК крім білка Int необхідні фагової білок xis і клітинний білок HF. Процес рекомбінаційну відщепленні, мабуть, має деяку схожість з процесом інтеграції, але роль зазначених трьох білків, особливо білка xis, все ще вивчається.

5. Реплікація

Освіта РНК-вмісних вірусів відбувається шляхом реплікації їх РНК, тоді як всі клітинні РНК утворюються в результаті транскрипції ДНК. Тут ми розглянемо лише процес реплікації вірусної РНК як такої, не торкаючись зв'язку реплікації з життєвим циклом відповідних вірусів.
За винятком ретровірусів, реплікація РНК в основному повторює процес реплікації ДНК. Ланцюги РНК також подовжуються на один нуклеотид за один акт у напрямі 5-> 3 'шляхом приєднання рібонуклеотідтріфосфата до 3'-ОН-кінця зростання ланцюга. Як і при реплікації ДНК, порядок розташування нуклеотидів визначається комплементарним копіюванням матриці, в даному випадку обов'язково ланцюга РНК. Ферменти, що здійснюють цей процес, називаються РНК-залежними репликазу.
РНК бактеріальних вірусів R17 і MS2, а також поліовірусов і вірусу Сіндбіс, що інфікують тварин, завжди позначається знаком, оскільки послідовність їх РНК-геномів ідентична послідовності мРНК. Таким чином, геном инфицирующего вірусу може служити як мРНК і містить інформацію про синтез деяких, якщо не всіх, вірусних білків. Специфічна репликазу, кодована геномом вірусу і що настає незабаром після інфекції, зв'язується з одним або декількома білками клітини-господаря і ініціює процес копіювання - ланцюга з його 3'-кінця з утворенням повній - ланцюга, асоційованої з - ланцюгом-матрицею. Потім та ж репликазу, можливо разом з іншими вірусними білками, синтезує безліч копій - ланцюга РНК, використовуючи новосинтезованих ланцюг як матрицю. З єдиною - матричної ланцюга РНК синтезується одночасно кілька нових - ланцюгів. У багатьох вірусів копіювання - або - ланцюгів ініціюється шляхом спарювання рібонуклеозідтріфосфата з першим нуклеотидом на 3'-кінці матричної ланцюга.
Ланцюг РНК поліовірусу реплікується способом, аналогічним представленому, але його геномна РНК має одну особливість - до її 5'-кінця за допомогою фосфодіефірних зв'язку приєднаний білок через тирозинових залишок. У - ланцюга, що синтезується в першому раунді реплікації, цей білок відсутній. Проте всі ланцюги, які утворюються на ланцюгу як на матриці, містять 5'-кінцевий білок, навіть коли їх довжина ще дуже мала. Це дозволяє припустити, що репликазу поліовірусов використовує гідроксильну групу тирозину в якості праймера при ініціації нових - ланцюгів, у той час як - ланцюга фермент може ініціювати de novo.
Геном деяких вірусів представлений одним ланцюгом РНК, нуклеотидна послідовність якої комплементарна, а не ідентична послідовності мРНК. Такі геноми позначають знаком. Існують також віруси, геном яких складається з множинних - ланцюгів РНК, при цьому кожен такий сегмент відповідає одному або двом вірусним генам. Якщо геном вірусу представлений однією або більше - ланцюгами РНК, то в самому вирионе міститься комплекс геномної РНК зі специфічної репликазу. Після проникнення в клітину комплекс активується, і на - ланцюгах як на матрицях синтезуються - ланцюга. Новосинтезовані - ланцюга грають роль мРНК для синтезу нових або додаткових реплікаційний білків і роль матриці при синтезі дочірніх - ланцюгів.
Геном деяких вірусів представлений дволанцюжкової РНК, що містить і -, і - ланцюга. Реплікація у таких вірусів також ініціюється ферментами, що містяться в самому вирионе. Ці ферменти копіюють - ланцюг дуплексу РНК консервативним шляхом - ланцюга відокремлюються). Білки-реплікази, що транслюються з цих - ланцюгів мРНК, синтезують потім комплементарні - ланцюги, які, об'єднуючись з - ланцюгами, утворюють дочірні дволанцюжкові РНК вірусу.
Наявні дані про структуру та функції РНК-репликазу дуже обмежені. Найбільш детально вивчена РНК-репликазу, синтезируемая РНК-коліфагів Qp. Вона складається з чотирьох ідентичних поліпептидів, причому тільки один з них кодується вірусним геномом. Цей поліпептид не здатний реплікувати - ланцюга вірусу, він може каталізувати лише обмежену реакцію приєднання рибонуклеотидов. Решта три білки, що входять до складу РНК-реплікази фага QP, є компонентами хазяйського апарату синтезу білка, і їх точна функція в процесі реплікації РНК невідома. Ініціація і реплікація, здійснювані РНК-репликазу, що кодуються, вірусами тварин, також залежить від активності білків, утворених клітиною-господарем. Відмітна особливість РНК-репликазу полягає в їх здатності незвичайної специфічно дізнаватися нуклеотидні послідовності на 3'-кінцях як і ланцюгів, що гарантує ініціацію синтезу нових ланцюгів.
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Курсова
146.4кб. | скачати


Схожі роботи:
Реплікація ДНК
Еволюція еукаріотичного геному
Роль геному у формуванні нейронних структур
Реплікація різних ДНК її регуляція і репарація
Генна модифікація
Модифікація поліелектролітів наночастинками
Модифікація конкурентно-ринкового механізму
Тест восьми потягів Сонди і його модифікація
Закон грошового обігу та його модифікація в різних типах грошових систем
© Усі права захищені
написати до нас
Рейтинг@Mail.ru