Новітні генні структури та їх аналіз

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.


Нажми чтобы узнать.
скачати

Введення
Часто новітні гени, що кодують білки одного метаболічного шляху чи що визначають близькоспоріднені функції, регулюються узгоджено. Експресія таких генів починається і закінчується або узгоджено триває у відповідь на один і той же регуляторний сигнал. Гени, об'єднані в оперон, транскрибуються з промотора, що знаходиться на 5'-кінці такої групи генів, у вигляді єдиної молекули РНК, яка в подальшому піддається процесу «дозрівання». Частина генів у хлоропластної геномі входить до складу Оперон. Це властивість вони успадкували від своїх попередників - синьо-зелених водоростей. Хлоропласти мають також прокаріотичної типу трансляційну систему і характерні для бактерій регуляторні транскрипційні елементи. Однак у процесі еволюції хлоропласти придбали та деякі еукаріотичні ознаки - наявність інтронів в генах, процес редагування РНК та ін

Особливості транскрипції генів Оперон
За допомогою методу run on транскрипції була вивчена інтенсивність транскрипції декількох Оперон пластому ячменю. Основою транскрипционной системи служили спеціалізовані хлоропласти, які були виділені з перших листків ячменю різного віку (4-х, 9-ти і 18-ти денні).
У ході реакції транскрипції (тривалість 10 хв) у знову синтезовані молекули РНК включався радіоактивно-мічений УТФ (α32P-УТФ), що дозволяло надалі детектувати тільки знову синтезовані транскрипти. Обмежений час реакції практично виключає вплив процесів деградації РНК на кількість синтезованих транскриптів.
Встановлено, що у більшості вивчених Оперон гени транскрибуються з різною інтенсивністю. Найбільш рівномірна транскрипція спостерігалася для rpo-оперону, що містить rpoB-rpoC1-rpoC2 гени. Необхідно відзначити, що це, ймовірно, єдиний оперон пластому ячменю, що складається тільки з генів, що кодують субодиниці одного білкового комплексу (субодиниці РНК-полімерази бактеріального типу). Інші оперон, які також мають більшість генів однієї функціональної групи, характеризувалися відмінностями в інтенсивності транскрипції генів.
Так, у оперона rps2-atpI-atpH-atpF-atpA зчитування РНК значно підвищувався (у 7-10 разів) для atpF гена в порівнянні з попередніми і подальшим геном. Транскрипція гена psaB в оперон psaA-psaB-rps14 так само була інтенсивніше як мінімум удвічі, ніж транскрипція першого і останнього генів оперону. Відзначено і значні зміни в оперона, що містять гени, що кодують компоненти різних функціональних груп хлоропластів. Так оперон atpB-atpE-trnV-ndhС-ndhK-ndhJ характеризується значно більшою інтенсивністю транскрипції генів atpB і trnV, у порівнянні з іншими генами (перевищення в середньому не менш ніж у 3 рази).
Структурно-термодинамічні дослідження генів
Проблема самоорганізації білків, тобто самовільного згортання поліпептидного ланцюга в унікальну просторову структуру, залишається однією з центральних у сучасній молекулярній біології і має три основних аспекти: структурний, термодинамічний і кінетичний.
Найбільш відповідними для дослідження самоорганізації є маленькі глобулярні білки, здатні підтримувати нативну структуру без додаткових факторів, таких як міцно пов'язані ліганди або дисульфідні містки.
Одними з найбільш популярних об'єктів досліджень є ізольовані SH3 домени, отримані у вигляді рекомбінантних білків. Раніше шляхом подовження центральної β - шпильки на вісім залишків було сконструйовано кілька химерних варіантів спектрінового SH3-домену. Передбачалося, що така вставка додасть β - шпильці додаткову стабільність, і вона буде виступати за межі глобули у вигляді «носа», у зв'язку з чим ці химерні білки були названі «Бержерак». Вони вже були використані для уточнення ряду кінетичних аспектів процесу самоорганізації, а в даний час вивчаються нами в якості зручною моделі для визначення термодинамічних параметрів освіти ізольованою β-структури.
Калориметричні дані були отримані нами для декількох варіантів Бержерак в широкому діапазоні pH при різних концентраціях білка. Згідно з цими даними теплове розгортання білків відбувається равновесно, оборотно і з хорошою точністю описується моделлю двох станів при низьких концентраціях білка і pH нижче 3,5. Тобто виступаючий ніс утворює з тілом домену єдину кооперативну систему, тепловий ефект розгортання якої вище теплоти денатурації вихідного білка в середньому на 14 кДж / моль.
З метою структурної інтерпретації отриманих даних методом рентгеноструктурного аналізу була визначена тривимірна структура одного з білків (так званого SHH варіанти), яка показала, що вставлений фрагмент дійсно утворює жорстку β-шпильку. У разі SHH взаємодія цих шпильок призводить до утворення тетрамеров в процесі кристалізації химер.
Пошук і картування елементів геномних послідовностей
Нами розроблено експериментальний метод селекції, ідентифікації і картування потенційних енхансерних елементів усередині довгих геномних послідовностей. Запропонований метод дозволяє проводити одночасний пошук усіх елементів, що виявляють енхансерних активність, серед безлічі коротких фрагментів ДНК, що перекривають досліджувану область геному.
Використовуваний в роботі підхід заснований на здатності енхансери активувати промотор репортерного гена. Набір коротких фрагментів ДНК, отриманих розщепленням ділянки довжиною 1 млн. пар основ хромосоми 19 людини, був клонований в спеціально сконструйований нами самоінактівірующійся ретровірусний вектор, що містить репортерний ген неоміцин-фосфотрансферази II під контролем мінімального промотора цитомегаловірусу.
Надалі був отриманий пул ретровірусних часток, якими інфікували клітини лінії HeLa, після чого, були відібрані неоміцин-стійкі клони, що містять інтегровані в геном конструкції з фрагментами ДНК, що володіють активністю енхансери. ДНК неоміцин-стійких клонів використовували для ампліфікації відповідних фрагментів, які потім клонували в плазмідний вектор. Таким чином, була отримана бібліотека потенційних енхансери. Клони бібліотеки секвенували і була побудована карта розташування енхансери в який нас локусі хромосоми 19 людини. Аналіз бібліотеки виявив 15 енхансери-подібних послідовностей в полигенно локусі хромосоми 19 людини довгою 1 млн. пар основ, енхансерних активність 13 з них була підтверджена в експериментах по транзієнтної трансфекції за допомогою системи подвійної люціферазной детекції. Знайдені послідовності переважно розташовані в 5 'прилеглих до генів областях або всередині інтронів.
Аналіз гена рослинних ізопероксідаз
Пероксидаза - один з поширених ферментів, інтерес до вивчення якого з роками не слабшає. Серед кодують рослинних пероксидаз, що утворюють велике мультігенное сімейство, особливе місце займають патоген-індуковані пероксидази, активність яких корелює з розвитком стійкості рослин до фитопатогенам. Раніше в лабораторії біохімії імунітету рослин ІБГ УНЦ РАН було показано, що деякі ізопероксідази у багатьох видів рослин характеризуються властивістю зв'язування з хітином.
На жаль, на тлі активного вивчення фізіологічних функцій пероксидаз роль структури хітин-зв'язуючого сайту в подальшому прояві рослинами стійкості до фитопатогенам залишається слабо вивченою. Можна припустити, що властивість сорбції пероксидаз на хітин пов'язано з наявністю загального полісахарид-зв'язуючого мотиву в їх амінокислотної послідовності, що передбачає і певну гомологію в структурі генів, що кодують їх.
Вивчення молекулярних механізмів регуляції окремих ізопероксідаз внесе внесок у розуміння фізіологічних основ стійкості рослин до фитопатогенам. Раніше, до нуклеотидної послідовності хітин-зв'язуючого сайту гена аніонної пероксидази пшениці були підібрані і сконструйовані праймери. З використанням даної пари праймерів нами була проведена ПЛР на ДНК різних видів пшениці, егілопса, арабідопсису і тютюну.
Виявлено, що у випробуваних видів пшениці та егілопса проявляється цільової амплікон розміром 190-200 п. н., Що збігається з теоретично розрахованими розмірами, отжигаются отриманими праймерами з гена аніонної пероксидази цих злаків. Даний факт підтверджує припущення про схожою організації цієї ділянки гена. Цікаво, що у Arabidopsis thaliana амплікон, отриманий після ПЛР, був розміром близько 150 п. н. Аналіз генів, що кодують пероксидази, за відомим з міжнародного генбанка нуклеїнових послідовностей Arabidopsis thaliana, показав, що з великої кількості генів пероксидази арабідопсису (70 генів) тільки в одного був подібний мотив розміром 175 нуклеотидів і близький до отриманого після ПЛР. При використанні ДНК Nicotiana tabacum, на жаль, не відбувалося формування шуканого амплікон. Оскільки аналіз відомих генів пероксидази Nicotiana tabacum також не виявив подібних послідовностей, можна припустити, що структура цього амплікон у тютюну відрізняється від отриманої для пшениці і вимагає підбору іншої пари праймерів. Таким чином, нами проведено аналіз розміру амплікон хітин-специфічного сайту пероксидаз з різних видів рослин. Більш точні результати передбачається отримати після секвенування амплікон цих видів і порівняння їх послідовностей.

Органна специфічність метилювання та експресії промотору гена пататіна
Промотор гена пататіна класу I - це тканеспеціфічний промотор, що забезпечує експресію гена головним чином в бульбах. Раніше було показано, що невисокий рівень експресії виявляється і в інших органах картоплі. Проведений нами кількісний флюоріметріческій аналіз функціонування пататінового промотора у трансгенних лініях картоплі сорту Дезіре B33:: GUS, де репортерний ген GUS поставлений під контроль пататінового (В33) промотора показав, що рівень експресії зменшувався в ряду бульба>> стебло> лист> корінь. Органна специфічність функціонування пататінових генів може залежати від епігенетичних механізмів, в тому числі метилювання ДНК. У даній роботі визначали рівень метилування залишків цитозину консервативного проксимальної ділянки В33-промотора. У досліджуваній ділянці (477 Н.О.) промотора виявлено два тетрануклеотидом GCGG, залишок цитозину яких є потенційним субстратом ДНК-метилаза.
Ступінь метилювання цих тетрануклеотидом визначали за допомогою метілчувствітельной рестріктази AciI, яка здатна розщеплювати впізнаваний сайт тільки в тому випадку, якщо він не містить метильований цитозин. Оброблені AciI препарати ДНК, виділені з різних органів / ліній картоплі, використовували як матриць для ПЛР з праймерами на досліджувану ділянку В33-промотора або на ділянку промотору та початок гена GUS. ПЛР на матрицях необроблених рестриктазою препаратів ДНК з різних органів призводила до напрацювання приблизно рівних кількостей ампліфікується ДНК В33-промотора. Це вказувало на схожість набору матриць та їх доступності в препаратах ДНК, виділених з різних органів рослини. Однак після рестрикції AciI кількості одержуваних амплікон сильно різнилися в залежності від джерела ДНК. Найбільш блідими були смуги амплікон, отримані з використанням рестріцірованних ДНК з бульб і листя аналізованих рослин. Це свідчить про значний ступінь розщеплення пататінового промотора рестриктазою AciI, тобто про низький рівень його метилювання в даних органах. Максимальний рівень метилування промотора був виявлений в коренях і стеблах рослин картоплі.
Істотних відмінностей між трансгенними і нетрансгеннимі рослинами картоплі по рівню метилювання GCGG-сайтів промотора не виявлено. Органна специфічність метилювання вбудованого В33-промотора в B33:: GUS-трансформанта була схожою зі специфічністю метилювання ендогенного пататінового промотора. Виявлена ​​суттєва зворотна кореляція між рівнем метилювання GCGG-сайтів В33-промотору та рівнем його активності в органах рослин. Разом з тим, неповна зворотна кореляція метилювання та експресії В33-промотора в різних органах передбачає участь, крім метилювання, та інших регуляторних чинників, що визначають органну специфіку промоторної активності.
Зміна розташування хромосомних генів
Згідно сучасним уявленням, як інтерфазних хромосоми, так і гени займають у ядрі досить жорстко певні радіальні положення. Вважається загальноприйнятим той факт, що близьке відстань між локусами може бути причиною незаконної рекомбінації між ними, часто приводить до розвитку лейкозів. Виникаючі в результаті транслокацій лейкози, можуть носити як первинний, так і вторинний характер. Виникнення вторинних лейкозів пов'язують з терапією раку інгібіторами ДНК топоізомерази II. ДНК топоізомераза II є життєво необхідним ферментом, так як каталізує топологічні зміни в ДНК в ході сегрегації дочірніх хромосом після завершення процесу реплікації ДНК, транскрипції, рекомбінації та реорганізації хроматину. Саме тому при терапії ракових захворювань застосовуються препарати, що інгібують активність топоізомерази II і викликають загибель активно діляться клітин.
У даній роботі досліджувався взаємне просторове розташування генів, які є частими партнерами при транслокації, що ведуть до виникнення первинних і вторинних лейкозів (AML / ETO, MLL/AF4, AF6, AF9, BCR / ABL).
Методом флуоресцентної in situ гібридизації (FISH) було показано, що радіальний розподіл флуоресцентних сигналів, відповідних гену ETO та хромосомної території 8-ої хромосоми під внутрішньоядерної просторі діляться клітин є випадковим. Також було показано, що при обробці клітин етопозидом (VP16) - інгібітором ДНК топоізомерази II - характер розподілу сигналів різко змінюється і сигнали, в значній мірі, групуються на внутрішньоядерної орбіті, відповідної 45% радіуса ядра.
Для частого партнера гена ETO по транслокація, гена AML, було показано, що основна маса сигналів, відповідних гену AML та хромосомної території 21-ої хромосоми в інтактних клітинах, зосереджена на тій же орбіті (45% радіуса ядра), і що таке розподіл сигналів не змінюється після обробки клітин етопозидом. Аналіз розміру геномної ДНК із застосуванням методу електрофоретичного розділення ДНК в пульсуючому полі показав виникнення значної частини розривів в ДНК внаслідок обробки клітин етопозидом.
Таким чином, продемонстровано, що в умовах, що імітують протиракову терапію, відбувається зближення генів ETO і AML. Це зближення, що супроводжується розщепленням ДНК інгібітором топоізомерази II, може вести до хромосомні транслокації та розвитку вторинних лейкозів.
Передбачається, що аналіз змін радіального розподілу можливих генів-партнерів по транслокація під внутрішньоядерної просторі діляться клітин при терапії онкологічних захворювань із застосуванням різних типів хіміотерапевтичних агентів, може лягти в основу тест-системи, спрямованої на прогнозування і запобігання випадкам виникнення вторинних лейкозів.
Модифіковані гени
Інтеграція ДНК вірусу імунодефіциту людини в геном клітини є ключовою стадією життєвого циклу вірусу, тому представляє інтерес розробка препаратів, що пригнічують активність вірусного ферменту інтегрази. До справжнього моменту знайдено ряд ефективних інгібіторів інтегрази, що діють на активний центр ферменту, проте швидко розвивається стійкість вірусу до цих препаратів робить актуальною розробку нових інгібіторів інтегрази.
Раніше нами було показано, що кон'югати 11-ланках одноланцюгових олігонуклеотидів з гідрофобними молекулами, такими як еозин, флуоресцеїн і олеїнова кислота, ефективно пригнічують активність інтегрази in vitro, зв'язуючись з комплексом інтегрази-вірусна ДНК і руйнуючи його. Для визначення ділянки зв'язування кон'югату було проведено ковалентное приєднання кон'югату олігонуклеотиду з флуоресціном до ферменту і протеолітична розщеплення продукту приєднання. Мас-спектрометричний аналіз утворилися нуклеотідопептідов дозволив встановити, що інгібітор взаємодіє з інтегрази поблизу Lys236 в C-кінцевому домені ферменту. Для підтвердження сайту зв'язування кон'югату ми провели заміну Lys236 у складі інтегрази на Ala. Така амінокислотна заміна різко знижувала як здатність ферменту пов'язувати вірусну ДНК, так і його каталітичну активність.
Грунтуючись на отриманих даних, ми висловили припущення про механізм дії кон'югатів. Згідно з нашими уявленнями, негативно заряджена олігонуклеотидно частина кон'югату зв'язується з С-кінцевим доменом інтегрази, що містить велику кількість позитивно заряджених амінокислот, за рахунок електростатичних взаємодій, у той час як гідрофобна частина проникає в гідрофобний кор домену.

Висновок
Таким чином для декількох Оперон виявлений ефект значної різниці інтенсивності транскрипції індивідуальних генів. Такі взаємодії між олігонуклеотидно кон'югатом і комплексом інтегрази з вірусною ДНК викликають конформаційні зміни в ферменті, що призводять до дисоціації комплексу. Ми вважаємо, що при заміні Lys236 на гідрофобний залишок Ala структура С-кінцевого домену аналогічним чином змінюється, що приводить до зниження каталітичної активності ферменту і його здатності зв'язувати вірусну ДНК. Таким чином, ми показали, що олігонуклеотидно кон'югати є високоефективними інгібіторами інтегрази ВІЛ-1, які, на відміну від більшості існуючих інгібіторів, зв'язуються поза активного центру ферменту і пригнічують активність інтегрази за новим механізмом.

Список літератури
1. Концепція переходу України до сталого розвитку. М., 2006.
2. Lande R. Statistic and partitioning of species diversity and similarity among multiple communities / / Oikos. 2006. V. 76.
3. Summerville KS, Boulware MJ, Veech JA, Crist TO Spatial variation in species diversity and composition of forest lepidoptera in eastern deciduous forests of North America / / Cons. Biol. 2008. V. 17.
4. Wagner HH, Wlidi O., Ewald CW Additive partitioning of plant species diversity in an agricultural mosaic landscape / / Landscape Ecology. 2009.
5. Гіляров М.С., Стріганова Б.Р. Кількісні методи в грунтової зоології. М. Наука. 2007.
6. Flegg JJM Extraction of Xiphinema and Longidorus species from soil by a modification of Cobb's decanting sieving technique / / Ann. Biol. 2007.
7. Seinchorst JW A rapid method for the transfer of nematodes from fixative to anhydrous glycerin / / Nematologica. 2007. Vol. 4.
8. Шестаков Л.С., 2008. «До вивчення вібраційних сигналів клопів-щитник (Heteroptera, Asopinae) європейської частини Росії. / / Зоол. Журнал Т. 87. № 1. с.36-41.
9. Gogala M., 2007. Vibration producing structures and songs of terrestrial Heteroptera as systematic character. / Biol. Vestn. 32. T. 1. P. 19-36.
10. Ванюшин Б. Ф. (2007) ензиматичні метилювання ДНК - епігенетичні контроль за генетичними функціями клітини / / Біохімія, № 70, 598-611.
11. Rocha-Sosa M., et al. (2009) Both developmental and metabolic signals activate the promoter of a class I patatin gene / / The EMBO Journal, № 8, р.. 23-29.
12. Юнусова А.К., Рогулін Е.А., Артюх Р.І., Залізна Л.А., Матвієнко І.Н. (2007) Ніказа N.Вsp6I - велика субодиниця гетеродімерной ендонуклеази рестрикції R.BspD6I / / Біохімія, т. 71, № 7.
13. Залізна Л.А., Перевязова Т.А., Альжанова Д.В., Матвієнко М.І. (2008) Сайт-специфічна ніказа із штаму Bacillus species D6 / / Біохімія, т. 66, № 9.
14. Kachalova GS, Rogulin EA, Artyukh RI, Perevyazova TA, Zheleznaya LA, Matvienko NI and Bartunik HD (2008) Crystallization and divliminary crystallographic analysis of the site-specific DNA nickase Nb.BspD6I. Acta Crystallographica F61.
15. Kim SH, Ryabov EV, Kalinina NO, Rakitina DV, Gillespie T, MacFarlane S, Haupt S, Brown JW, Taliansky M. Cajal bodies and the nucleolus are required for a plant virus systemic infection.EMBO J. 2008 Apr 18; 26 (8) :2169-79. Epub 2007 Apr5.
16. Kim SH, Macfarlane S, Kalinina NO, Rakitina DV, Ryabov EV, Gillespie T, Haupt S, Brown JW, Taliansky M. Interaction of a plant virus-encoded protein with the major nucleolar protein fibrillarin is required for systemic virus infection. Proc Natl Acad Sci US A. 2007 Jun 26; 104 (26) :11115-20. Epub 2008.
17. Чортопруд М.В., 2008. Джерельні спільноти макробентоса Московської області / / Журнал Загальної Біології. 67. 5.
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Реферат
37.5кб. | скачати


Схожі роботи:
Генні хвороби
Аналіз фінансово-господарської діяльності підприємства 2 Аналіз структури
Новітні біотехнології
Аналіз структури конфлікту
Аналіз структури конфлікту 2
Новітні технології в банківських послугах
Новітні досягнення в освоєнні космосу
Новітні досягнення сучасної хімії
Аналіз структури конфлікту 2 Конфлікт як
© Усі права захищені
написати до нас