Нейтрофіли

Анотація

Створена і реалізована, у вигляді комп'ютерної програми, математична модель руху популяції клітин. Показано, що широко прийняте в літературі поділ нейтрофілів на повільні, середні та швидкі слід вважати умовним. Експериментальні вимірювання швидкостей нейтрофілів в популяції розподілені безперервно. Модель піддає сумніву широко прийняте думку про існування пам'яті нейтрофілів. Експериментальні дані добре описуються в рамках марковської моделі. Що спостерігається в експерименті закономірне повернення деяких нейтрофілів до початкової точки пов'язано тільки з недоліком статистики для вимірювання середньоквадратичного відхилення на великих часах.

Зміст

Введення

В даний час рухливість нейтрофілів розглядається, як дуже важливий показник фізіологічного стану лейкоцитів у боротьбі з інфекцією. З порушенням рухливості нейтрофілів пов'язують багато захворювань. Тому вивчення механізму руху представляє актуальну задачу сучасної медицини. На сьогоднішній день накопичений досить великий матеріал, який дає змогу будувати гіпотезу щодо руху нейтрофілів. Проте ці гіпотези важко перевірити експериментально тому, що ці методи засновані на покадрової зйомки з фіксованим тимчасовим інтервалом. Просте візуальне спостереження не дозволяє накопичити достовірний матеріал, тому доводиться вдаватися до математичного моделювання.

Модель показує, яке велике значення в оцінки рухової активності нейтрофіла має вибір величини міжкадрового інтервалу.

У наших експериментах, для оцінки зовнішнього руху (переміщення порівнянне з діаметром клітини) був обраний однохвилинний міжкадровий інтервал, а для оцінки руху, пов'язаного зі змінами площі клітини, був обраний двосекундною інтервал.

Завданням дипломної роботи було створення математичної моделі руху популяції клітин. Ця модель повинна імітувати процес руху клітин, процес вимірювань основних характеристик руху. А отримані на моделі результати повинні порівнюватися з відповідними експериментальними даними, отримані в інституті хірургії ім О. В. Вишневського.

Фізіологія нейтрофілів

Загальна характеристика

Нейтрофіли - одні з типів білих кров'яних клітин - лейкоцитів.

рис. 1 Нейтрофіли

Нейтрофіли численні і дуже рухливі клітини. При появі бактерій нейтрофіли починають активний вихід у тканини, де рухаються у вогнище запалення за допомогою різних реакцій інактивують (поглинають і руйнують бактерії).

Нейтрофіли - виявляють наступні функції:

1. Здатність до адгезії (прилипання) і зміна форми.

2. Здатність до руху

а) випадкове блукання;
б) хемотаксис (спрямований рух окремих клітин під впливом односторонньо діючого стимулу - хімічної речовини)
в) хемокінез (реакція на зовнішній стимул, що виражаються у зміні швидкості, частоти, зміни періодів руху або частоти і амплітуди поворотів під час випадкового блукання.)

3. Здатність до розпізнавання чужорідних агентів.

Нейтрофіл за допомогою рецепторів розпізнає бактерії.

4. Здатність до фагоцитозу.

Фагоцитоз - активне захоплення і поглинання частинок - нейтрофілами. Фагоцитоз - одна із захисних реакцій організму, головним чином при запаленні, відкритий в 1883 р. І. І. Мечниковим.

5. Мікробіцидність активність.

Продукція кисневих радикалів і секреція ферментів, що містяться в гранулах.

Порушення будь-якої з цих функцій нейтрофіла призводить до ускладнення запальної реакції. (Quie PG Mills EL, McPhail LC Johnston RB 1987)

Нейтрофіли дозрівають у кістковому мозку протягом 6-11 днів, після чого виходять у кров'яне русло, де пересуваються струмом крові і дозрівають близько 10 годин. Зрілі нейтрофіли виходять в тканину, де рухаються від 24 до 48 годин.

При інфекції кінетика цих процесів прискорюється (RepoH 1987).

Розрізняють 3 стани існування нейтрофілів:

1. Клітини кістковомозкового резерву. Такі клітини відрізняються меншою адгезивність і хемолюмінісценціей на дію активатора.

2. Клітини пасивно циркулюють у кров'яному руслі.

3. Клітини прикріплені до шару клітин, що вистилають внутрішню поверхню кров'яних і лімфатичних судин. Вихід нейтрофілів в тканину відбувається через 2-4 години після появи інфекції.

Існує 3 етапи виходу нейтрофілів у тканину:

1. Крайове стояння лейкоцитів у внутрішньої поверхні ендотелію судин запаленої тканини.

2. Діапедез - проходження лейкоцитів через стінку ендотелію (триває кілька хвилин).

3. Рух нейтрофілів в області запалення.

Вийшовши в тканину, нейтрофіл починає активний рух в області запалення.

Рецептори в плазматичній мембрані

У спочиваючому стані нейтрофіли дуже слабо виявляють свої можливості, але вони можуть бути активовані через мембранні рецептори. Є рецептори на певні речовини які виділяються в тканинах у процесі запалення. Специфічні рецептори на мембрані ідентифіковані для C _5a білкового фрагмента комплементу, N - форміл - пептиду, ліпідного хемоаттрактантов лейкотрієну B ₄ (Snyderman R, Goetzl EJ 1981). Фрагмент комплементу C _5a утворюється в плазмі крові при активації компліменту. N - форміл-пептид є продуктом бактерій, і мітохондрій пошкоджених тканин. LTB ₄ - Ліпідний медіатор, який вивільнюється при активації різних клітин, в тому числі і самих нейтрофілів. До розпізнавання чужорідних для організму часток і поглинання їх є мембранні рецептори до C _3b і C _3bi факторів комплементу. При адгезії нейтрофілів до ендотелію судин, є рецептори адгезії - інтегрини і селектину (Springer TA 1990). Взаємодія інтегринів з адгезивними білками, що містять специфічну амінокислотну послідовність Arg - Gly - Asp (RGP - послідовність) впливає на адгезивність клітин, і беруть участь в активації нейтрофілів. RGP послідовність пригнічує респіраторний вибух нейтрофілів на форміл - пептид і, можливо, захищає їх від спонтанної активації в кров'яному руслі.

Механізми активації нейтрофілів

Під активацією нейтрофілів маються на увазі швидко наступаючі зміни фізіологічної і біохімічної активності при дії зовнішнього сигналу. Критерієм активованого стану прийнято вважати появу респіраторного вибуху і секреторної дегрануляції (Маянскій А. Н., Маянскій Д. М. 1989).

Найбільш характерним відповіддю нейтрофілів на приєднання агоністів до рецепторів є накопичення в нейтрофілах перекису водню для того, щоб вбити бактерії нейтрофіл напрацьовує активні радикали кисню, знищуючи при цьому не тільки бактерії, але й інші клітини організму - господаря. Респіраторний вибух підпорядковується сильному контролю з - за того, що його продукти високо реактивні і токсичні. Такий «вибух» спрямований і проти організму - господаря і призводить до пошкоджень тканин. При сильних пошкодженнях тканин у хворих, коли є можливість хірургічного втручання, антибактеріальної терапії, лікарі уникають природного перебігу запального процесу і застосовують протизапальну терапію.

У зрілих нейтрофілах існує два основних типи гранул: азурофільних і специфічні. При впливі на нейтрофіли розчинними агоністами відбувається дегрануляція нейтрофілів. Частина гранул, розташованих поблизу плазматичної мембрани зливається з мембраною і вміст гранул вивільняється в позаклітинне середовище. З зовнішньої клітинної мембраною зливаються спочатку специфічні гранули і вже потім - азурофільних. Такий тип дегрануляції характерний для «нереалізованого фагоцитозу». При відбувся фагоцитозі бактерія захоплюється мембраною нейтрофіла з усіх сторін, потрапляє в цитоплазму, де відбувається її руйнування.

У нейтрофілах виявлені універсальні механізми передачі сигналів через G-білки, систему вторинних месенджерів і фосфорилювання за участю протеїнкіназ. G - білки представляють сімейство гомологічних білків, плазматичної мембрани, які переносять інформацію з рецепторів на ряд мембранних ферментів. Через G - білки діють всі агоністи, що регулюють активність аденилатциклаза, фосфоліпази А _2, калієвих каналів. Фермент аденілатциклази є інтегральним білком плазматичної мембрани, цей фермент відповідає за синтез сАМР в клітині. Одним з ранніх подій після взаємодії хемоаттрактантов з рецепторами є гідроліз мембранних фосфоліпідів та освіта біологічно активних ліпідів. У процесі активації нейтрофілів беруть участь три типи фосфоліпаз: Фосфоліпаза А ₂ (PLA _2), фосфоліпаза С (PLC), фосфоліпаза D (PLD) (Thelen et al. 1993).

Активація фосфоліпази С хемоаттрактантов здійснюється через G - білки. Фосфоліпаза З розщеплює фосфолипид з утворенням двох вторинних мессенжіров. Інозітолтрісфосфата (IP ₃₎ і діацилгліцеринів (DAG). Інозітолтрісфосфат зв'язується з рецепторами на внутрішньоклітинних запасниках кальцію, локалізованих поблизу плазматичної мембрани. Зв'язування IP ₃ з рецепторами індукує вивільнення, Са ^{+ +} із запасників і збільшення концентрації вільного Са ^{+ +} в цитоплазмі. Інший вторинний мессенжер діацилгліцеринів залишається асоційованим з плазматичною мембраною і активує протеїн С (Omann et al. 1987, Thelen et al. 1993).

Механізм активації фосфоліпази А ₂ невідомий.

Фосфоліпаза D нейтрофілів Са ^{+ +} залежна, вона гідролізує фосфатидилхолін з утворенням потенційного вторинного мессенжіра - фосфатидний кислоти. Фосфатидний кислота розщеплює з утворенням діацилгліцеринів - фізіологічного активатора протеїнкінази С. Процеси протікають на плазматичної мембрани при взаємодії легандов з рецепторами приводить до утворення в клітині низькомолекулярних продуктів циклічних нуклеотидів, діацилгліцеринів, іони кальцію.

Циклічні нуклеотиди не є активаторами нейтрофілів, хоча короткочасне збільшення сАМР в нейтрофілах спостерігається при різних рецепторних активаціях. Збільшення вмісту сАМР пригнічує рухову активність нейтрофілів. (Галкін А.А. та співавт. 1994)

Самро не блокує швидкого збільшення внутрішньоклітинного Са ^{+ +} при активації нейтрофілів хемоаттрактантов. (Takenawa T., Ishitoya J., Nagai Y. 1986).

Дібутірільний сGMP сам по собі не викликає активацію нейтрофілів і модулює активацію нейтрофілів викликану різними хемоаттрактантов сGMP в концентраціях на відміну від сАМР, значно посилює міграцію нейтрофілів (Галкін А.А. та співавт. 1994).

Іони кальцію основною частиною знаходиться у зв'язаному стані і полягають у ядрі і мітохондріях. При стимуляції нейтрофілів хемоаттрактантов відбувається Са - залежне короткочасне минуще збільшення внутрішньоклітинної концентрації Са ^{+ +,} що забезпечується з 2х джерел; швидкого вивільнення Са ^{+ +} із обмінюваного внутрішньоклітинного джерела і надходження Са ^{+ +} ззовні. Ззовні Са ^{+ +} надходить через плазматичну мембрану, проходить через рецепторуправляемие кальцієві канали. Підтримка рівноваги концентрації Са в клітині забезпечується з одного боку виведенням Са ^{+ +} з цитоплазми кальцієвими насосами, з іншого надходженням Са ^{+ +} з навколишнього розчину. Участь Са ^{+ +} в регуляції активності нейтрофілів не ясно. Можна сказати, що рухливість нейтрофілів або не пов'язана із змінами, або пов'язана з невеликими локальними змінами внутрішньоклітинної концентрації Са ^{+ +.}

Форболових ефіри активують нейтрофіли, викликають дегрануляцію, респіраторний вибух, збільшення вмісту F - актину без збільшення внутрішньоклітинної концентрації Са ^{+ +.}

Діоцілгліцерін викликає активацію специфічного ферменту клітин протеїнкінази С. протеїнкінази С активується на короткий час, але наслідки її активації мають тривалий характер.

Рухливість нейтрофілів

Лейкоцити здатні рухатися в тканинах і через стінки судин, а також по поверхні чужорідного субстрату (скло). При русі клітина змінює форму.

рис. 2 Рух нейтрофіла по субстрату.

Руховий акт у повзаючих клітин починається з освіти на передньому кінці клітки відростка - ламеллоподіі, далі у виступ, утворений прозорою безструктурної цитоплазмою, переливається рідка зерниста цитоплазма тіла лейкоцита. Формування відростків представляє активний процес, тому що рушійна сила та енергія закладено всередині самої клітини. Відростки в залежності від середовища мають різну форму, вони можуть бути у вигляді вузьких довгі мікровиростов, сплощені ламеллоподій, а також у формі бульбашок (Адо А. Д. Патофізіологія фагоцитів 1961). Ламеллоподіі утворюються спонтанно на всіх краях клітини, але здатність пересувати клітку набуває та ламеллоподія, яка вступила в контакт з субстратом (Stossel TP 1993) .. Контакти можуть бути як з поверхнею іншої клітини, так і з не клітинної поверхнею. Ламеллоподіі можуть бути як різної форми, так і різних розмірів. Кінець відростка, торкнувшись поверхні, може утворити міцний контакт. Нейтрофіл під час руху утворює широку псевдоподии на передньому кінці і вузькі відростки на бічних поверхнях клітини.

За допомогою інтерференційної мікроскопії розрізняють 2 області контакту. Рухаючись, нейтрофіл утворює область щільного прилипання, це хвіст і бічні відростки клітини, а область менш щільного прилипання утворюється з тілом клітки. Так як лейкоцит здатний рухатися по неклітинних поверхні (скла), то можна спостерігати, як клітина втрачає частину мембранного і цитоплазматичного матеріалу у вигляді сліду на склі. Це свідчить про щільному контакті з субстратом. Щоб послабити щільність контакту треба збільшити концентрацію сироваткового альбуміну (King C. et. Al 1980).

Натяг відростка примикає до субстрату підтягує клітку і утворює нову ділянку для контакту із субстратом. Реакції прилипання повторюються багато разів і складають процес распластиванія клітин (Васильєв Ю.М., Гельфанд І.М. 1977). Відросток, який щойно почав утворюватися не може прикріпитися до субстрату (склу) (King CA, Preston TM, Miller RH Donovan P. 1980).

Потім йде реакція стабілізації, яка призводить до поділу краю клітини на активні і неактивні ділянки. Поділ призводить до витягування клітини в передньо-задньому напрямку і робить її асиметричною. Отже, рух клітини стає можливим лише після виникнення асиметрії. Але до цих пір незрозуміла роль біжучої хвилі скорочення від переднього краю до тіла клітини і загального скорочення кортикального матрекса в хвості клітини. Деякі автори вважають, що скорочення в області хвоста беруть участь у продавлюванні цитоплазми з тіла клітини в ламеллоподію (Coates TP et. Al 1992).

На задньому кінці рухається клітини є хвіст і ретракционное волокна. Хвіст представляє скупчення на кінці клітини решт ретракційних волокон. Хвіст нейтрофіла адгезиви до субстрату і в ньому спостерігаються скорочення. Новоутворена ламеллоподія вступаючи в контакт із субстратом створює натяг у хвості клітини, викликаючи цим його відрив від субстрату і переміщення клітини вперед. Коли переміщення клітини здійснилося, ламеллоподія зникає і настає короткочасне «покоїться стан». Потім знову починають утворюватися нові ламеллоподіі і ретракционное волокна, і все повторюється спочатку (Нерсесова 1977).

Цитоплазма у нейтрофілів знаходиться в постійному русі. Коли клітина перебуває в стані спокою, то струми цитоплазми безладні, а коли клітина рухається, вони спрямовані всередину ламеллоподіі на провідному краї.

Нейтрофіл здатний проводити скорочення. Це передбачає наявність скорочувальних структур. Актин і міозин - білки, які знаходяться в м'язових клітинах. У нейтрофілах, які не мають м'язових структур, тим не менш, є білки схожі з актином і міозином. Актиноподібних білок дуже схожий на м'язовий актин за молекулярною вагою, структурної організації, здатності активувати міозінових АТФазу, зв'язуватися з міозином. У клітин, які мають не м'язову рухливість, актин разом з міозином становить скоротливу систему, але при цьому актин виступає як структурний білок. У не м'язових клітинах 50% актину знаходиться в неполімерізованной формі (G - актин), а в м'язових клітинах актин на 100% полімеризовані (F - актин). Такий зміст актину G і F в не м'язових клітинах обумовлено взаємодією актину з актин - зв'язуючими білками. Відомо більше 100 актин зв'язуючих білків. Альфа - актінін зшиває філаменти F - актинового гелю. Інший важливий білок це гельзолін. Він бере участь у локомоції (рух забезпечує активне переміщення у просторі) і транспорті везикул (бульбашок) через кортекс.

Міозіноподобние білки складають дуже малий відсоток (від 0.2-0.8% від загального вмісту білків клітини). Молярне ставлення актину до міозин в поліморфноядерних лейкоцитах складає 100:1. (Crawford N., Chahal., Jackson P. 1980) Міозіноподобние білки є ферментами, вони мають АТФазной активністю і здатністю з'єднуватися з актином. (Красовська І.Є. 1977; Omann GM et al 1987).

Передбачається, що в області псевдоподий актин деполімеризований. Асиметрія F - актину виникає ще в неполяризованих клітинах при активації їх хемоаттрактантов і передує виникненню клітинної асиметрії. Зниження вмісту F - актину зменшує жорсткість актинового каркаса клітини і каркас продавлюється в області де сталася деполімеризація актину. Початкова реакція полімеризації актину не залежить від концентрації Ca ^{+ +} в нейтрофілах, а реакція деполімеризації актину залежить від внутрішньоклітинного Са ^{+ +.} Друга фаза полімеризації актину залежить від концентрації внутрішньоклітинного Са ^{+ +} і можливо пов'язана з функціями нейтрофіла, такими як респіраторний вибух і дегрануляція. Одночасно з полімеризацією актину при дії хемоаттрактантов відбувається фосфорилювання міозину. Фосфорилювання міозину і виявлення міозину в області псевдоподии вказує на участь скорочувального апарату в освіті псевдоподии. (Omann GM et. Al 1987)

Вимірювання пройденого шляху

Найбільш природний показник руху клітини в експерименті, вважається пройдений шлях. На рис. 12 можна спостерігати наростання пройденого шляху в залежності від часу.

рис. 12 Залежність пройденого шляху від часу. Три групи клітин (max_step: 3, 10, 30 mcm - співвідношення 15:30:55)

Показано рух 15 клітин з 30, які генерувала модель. Найбільш дивним у експерименті був факт постійної швидкості руху клітин протягом усього експерименту, не дивлячись на випадковий характер їх руху. Модель добре відтворює цей факт, при цьому випадкові коливання швидкості практично непомітні. Кожна окрема крива представлена ​​на рис. 12 добре відповідає експериментальним даними рис. 13. Однак з порівняння рис. 12 і рис. 13 видно, що в експерименті існують всі варіанти швидкостей руху, а в модельному експерименті, чітко виділяються три групи клітин.

рис. 13 Залежність пройденого шляху від часу (експеримент)

рис. 14 Залежність пройденого шляху від часу. Три групи клітин (max_step: 3, 10, 30 mcm співвідношення 1:1:1)

Таким чином, умовний розподіл клітин на групи, введене експериментатором не може бути основою для моделювання. При зміні процентного складу клітин в популяції рис. 14 видно, що характер розподілу клітин за швидкостями не змінюється. В обох випадках чітко виділяються три групи клітин, які й були закладені в модель.

При моделюванні популяції був проведений ще один експеримент рис. 15, всі параметри руху були такими, як і в попередньому експерименті.

рис. 15 Залежність пройденого шляху від часу. Три групи клітин (max_step: 3, 10, 30 mcm, співвідношення 1:1:1 час вимірювання кожен десятий крок)

Однак «теоретичний спостерігач» мав можливість реєструвати положення клітин тільки на кожному 10-му кроці. У цьому випадку існування трьох груп клітин практично не видно. Це пов'язано з тим, що траєкторія руху клітин заплутана. Часто зустрічаються випадку, коли клітини за 10 кроків встигають повернути на зад. Таким чином, на якихось ділянках траєкторії «виникає ілюзія» малих кроків у швидких клітин і виникає картина, схожа на експериментальну. Цікаво відзначити, що максимальна швидкість вимірювання впала в 3 рази (приблизно  10) в порівнянні із заданою в програмі. Останній розрахунок вказує на те, що вибір інтервалу часу, для послідовного положення клітин, дуже суттєвий.

В експериментах положення клітини оцінювалося як положення її центра мас. Ясно, що координати змінюються від зміни форми клітин. З цього випливає, що чим менше інтервал часу, між вимірами, тим точніше вимірювання швидкості. Однак зсув центру мас на відстань менше розміру клітин не можна вважати стійким. У результаті, для вимірювання швидкості був обраний інтервал 1 хвилина, який приблизно відповідає зсуву середніх клітин на відстань порядку їх розміру.

Останній малюнок не дивлячись з його схожістю з експериментом не може вважатися істинним. Таким чином приходимо до висновку, що розподіл зроблене експериментатором на швидкі, середні та повільні клітини дуже умовно і його можна приймати тільки як якусь мнемоніку.

Таким чином, було введено принципова зміна в моделі рис. 1 6. У популяції присутні клітини з безперервно розподіленими швидкостями, а не три яскраво виражені групи. Розподіл хвилинних зрушень для кожної клітини було принципово таким же, як і в попередній моделі. Зрушення розподілені від 0 до r _max, а величини r _max в популяції були розподілені відповідно до такого ж розподілом. Генерувалася випадкова популяція клітин, після чого для кожної клітини генерувалися зрушення, і розраховувалося рух клітин в популяції. Результат розрахунку, показаний на рис. 1 6, повністю співпадає з експериментальним. Ми моделювали не тільки переміщення, але і процес вимірювання переміщень. Процедура вимірювань переміщень переглядала всі рухомі клітини, не знаючи до якої групи належить кожна з них.

рис. 16 Залежність пройденого шляху від часу. Клітини розподілені безперервно (max_step: 30 mcm, співвідношення випадкове, час вимірювання кожен крок)

У результаті вона змішувала всі клітини і будувала гістограму
рис. 1 7 - 1 9. Всі отримані гістограми не мали характерних особливостей і були, в принципі, схожі один на одного. У результаті приходимо до важливого висновку - вимірювання гістограм, в експерименті, не дає суттєвої інформації про характер руху. Такий же висновок буде зроблений і в паралельній роботі при більш детальному аналізі кожної окремої клітини.

рис. 17 Гістограма хвилинних зрушень. Три групи клітин (max_step 3, 10, 30 співвідношення клітин 15:30:55)

рис. 18 Гістограма хвилинних зрушень. Три групи клітин (max_step 3, 10, 30 співвідношення клітин 1:1:1)

рис. 19 Гістограма хвилинних зрушень. Три групи клітин (max_step 3, 10, 30 співвідношення клітин 1:1:1, час вимірювання кожен десятий крок)

Дослідження залежності середньоквадратичного відхилення від часу спостереження

Як відомо з теорії Броунівського руху, важливим показником випадкового блукання є середньоквадратичне відхилення. Ми використали цей показник для руху нейтрофілів. Перш за все, ми розглядали частку, у якої кути поворотів розподілені рівномірно, тобто клітка з однаковою ймовірністю може повернути в будь-яку сторону. Результат показаний на рис. 20.

рис. 20 Расномерное розподіл кутів.

На цьому малюнку по осі ординат відкладений ln часу. По осі абсцис відкладено ln середньоквадратичного відхилення клітини. Як показано Ейнштейном і Смолуховським для броунівський частинки, ця залежність відображається прямої з нахилом 0,5. Як видно, наша крива добре лягає на пряму з нахилом 0,5. Для порівняння, на цьому ж графіку проведена пряма з нахилом 1. Якби клітина не поверталася взагалі, то її середньоквадратичне відхилення лягло б на пряму з нахилом 1. Результат показаний на рис. 21.

рис. 21 Майже нульовий кут поворотів.

Тут про всяк випадок залишили невеликий ймовірність (2%) повороту на 18 ^0. У результаті середньоквадратичне відхилення цих клітин злегка відхиляється від прямої.

При завданні у моделі експериментально виміряних розподілів кутів поворотів рис. 22 отримали криві разюче схожі на експеримент. На початку, середньоквадратичне відхилення йде вздовж прямої з нахилом 1, потім відхиляється і асимптотично прагнути до нахилу 0,5 рис. 23 - 24. Такий характер залежності в літературі прийнято трактувати як клітинну пам'ять. У нашій моделі процес був принципово марковским. У кожний момент часу розподіл кутів і зрушень не залежало від передісторії. І тим не менш картина відтворювалася з точністю до часів. Звичайно якщо трактувати пам'ять у побутовому сенсі, то елементи пам'яті в моделі є. Все-таки нульовий кут повороту по відношенню до попереднього кроку є кращим.

рис. 22 Гістограми кутів заданих поворотів.

рис. 23 Звичайне розподіл кутів fast.

рис. 24 Звичайне розподіл кутів slow.

рис. 25 Гістограма кутів заданих поворотів (хемотаксис)

Однак пам'яті, в математичному сенсі, в моделі немає.

Якщо ми зробимо нульовий кут ще більш кращим рис. 25, то природно отримаємо криву середньоквадратичного відхилення, дуже близьку до кривої, одержуваної при хемотаксисі.

Дуже важливий результат, для нашої експериментальної групи, можна бачити на рис. 23. Крива середньоквадратичного відхилення на великих часах починає знижуватися з негативним нахилом. Природно, що для броунівський частинки це неможливо. З моделі ясно, що це відхилення пов'язано з недоліком статистики для обчислення останніх точок. На рис. 26 наведені графіки багатьох клітин.

рис. 26 Залежність середньоквадратичного відхилення. Клітини розподілені безперервно (max_step: 30 mcm співвідношення випадкове час вимірювання кожен крок)

Видно, що в якихось клітинах це явище спостерігається або не спостерігається взагалі або загинається «хвостик» вгору. Загинання «хвоста» вниз в експерименті може означати тільки одне, клітина закономірно стала повертатися до вихідної точки. У результаті стало виникати підозра, що на експериментальних скельцях є якісь умови (наприклад подряпини), які забезпечують не випадкове рух. Така підозра ставить під сумнів і всі інші результати.

На моделі нам вдалося показати, що це, швидше за все, тільки недолік статистики для обчислення останніх точок. І їх не потрібно брати до уваги.

Висновок

В останні роки в літературі намітився швидке зростання кількості робіт, присвячених руху клітин крові - нейтрофілів. Це пов'язано з двома основними факторами: поява нових сучасних методів вивчення руху і бурхливим наростанням знань про внутрішньоклітинної регуляції життєво важливих процесів.

Встановлено, що на сьогоднішній день обсяг знань в медицині наростає в півтора - два рази швидше, ніж в будь-якій іншій науці. Нові методи вивчення руху клітин пов'язані в першу чергу з розвитком систем аналізу зображення. Ясно, що ці методи мають велику перевагу над традиційними, які спиралися на вивчення «дифузії» популяції. Методи аналізу зображення дозволяють вивчати не тільки міграцію клітин, але й зміна їх форми, пов'язане з витягуванням псевдоподии. В даний час накопичений дуже великий матеріал з формального опису руху клітин, розвинена теорія опису руху, заснована на аналізі випадкових процесів. Однак багато питань залишаються до сих пір незрозумілими. Почасти це пов'язано з браком знань і не можливістю провести прямі вимірювання параметрів ряду процесів, що визначають рух клітини. Наприклад, з експериментальних даних ясно, що рух клітин пов'язані з їх прилипанням до скла, за яким вони рухаються. Якщо клітина не прилипає до скла взагалі, то вона не рухається. Якщо ж вона прилипає дуже сильно, то вона знову не в змозі рухатися. До цих пір не існує методів вимірювання ступеня прилипання клітини до скла. Зрозуміло в розпорядженні дослідника навіть немає коштів для вимірювання багатьох фізичних характеристик руху, але він має безліч можливостей змінювати ці характеристики. У цих умовах, важливим кроком, який може забезпечити подальші дослідження, є математичне моделювання. Математичне моделювання дозволяє досліднику впорядкувати і систематизувати наявні знання. Перевірити несуперечність висунутих гіпотез і виділити суттєві і не істотні фактори висловлюваних у них.

Модель руху популяції нейтрофілів не враховувала зміна форми окремих клітин, а обмежувалася результуючими параметрами кожної клітини. Клітка могла переміститися у випадковому напрямку (розподіл кутів поворотів задавалося на випадкове відстань), на випадкове відстань (розподіл також задавалося). Популяція була розбита на 3 групи: повільні, середні та швидкі. Цей розподіл було взято з експериментальної практики, при цьому модель враховувала навіть процентне співвідношення в популяції. В результаті моделювання встановлено, що перша з залежностей (залежність пройденого шляху від часу) абсолютно не відповідає експериментальній. Положення не рятувало і зміна відсоткового складу клітин в популяції. Єдиний вихід, підказаний моделлю, це відмова від розподілу популяції на групи і введення безперервно розподілених швидкостей.

Моделювання вибору інтервалу часу для вимірювань послідовних положень клітин, для виміру швидкостей, показало, що не тільки значення миттєвих швидкостей залежить від інтервалу, що саме по собі очевидно. Вибір занадто великого інтервалу «розмазує» популяційні характеристики руху, наближаючи модельну картину до експериментальної. Це дуже небезпечний артифактом. Як і обговорюється в главі результати досліджень, часовий інтервал для вимірювання миттєвих швидкостей повинен бути порядку часу переміщення клітини на відстань порівнянне з її розміром. При цьому показано, що навіть при «правильному вимірі» побудова гістограм елементарних переміщень практично не несе ніякої інформації ні про характер руху клітин, ні про популяційному складі. Вивчення класичного параметра випадкового руху - середньоквадратичного відхилення показало, що на малих часи клітини ведуть себе як об'єкти, що рухаються цілеспрямовано. На великих часи клітини ведуть себе як броунівський частинки.

Застосування речовин, які привертають клітку до себе (хемоаттрактанти) збільшують інтервал часу, протягом якого клітина рухається цілеспрямовано. Саме по собі це не дивно. Однак у літературі широко прийнято пов'язувати це явище з клітинної пам'яттю. Наша модель була в принципі марковської. У ній не було пам'яті в строгому сенсі слова. У не строго сенсі якийсь елемент, який можна трактувати як пам'ять був. Нульовий кут повороту був більш кращий, а при застосуванні хемоаттрактантов ймовірність нульового кута збільшувалася. Тим не менш модель відтворювала експериментальні дані з разючою точністю. Відтворювалося навіть час з цілеспрямованим рухом. Таким чином спроби інтерпретації цього часу як клітинної пам'яті викликають серйозні сумніви. Дуже важливими виявилися результати моделювання середньоквадратичного відхилення на великих часах. Графік залежності середньоквадратичного відхилення від часу починає відхилятися від теоретичного у випадковому напрямку, в плоть до того, що середньоквадратичне відхилення починає зменшуватися. Ця особливість, отримана в експерименті, «викликало паніку» у експериментаторів. Зменшення середньоквадратичного відхилення можна було інтерпретувати тільки як цілеспрямоване повернення клітини назад. Фізично це можна уявити собі як повернення клітини уздовж деякого дефекту підкладки, невидимого в мікроскоп. Зрозуміло, це ставить під сумнів якість усього експерименту. На моделі показано, що це явище пов'язане лише з недоліком статистики для останньої ділянки кривої.

Висновки

1. Створено популяційна математична модель випадкового блукання нейтрофілів, яка описує основні характеристики руху;

2. Широко прийняте в літературі поділ нейтрофілів на повільні, середні та швидкі слід вважати умовним. Експериментальні вимірювання швидкостей нейтрофілів в популяції розподілені безперервно;

3. Модель піддає сумніву широко прийняте думку про існування пам'яті нейтрофілів. Експериментальні дані добре описуються в рамках марковської моделі;

4. Що спостерігається в експерименті закономірне повернення деяких нейтрофілів до початкової точки пов'язано тільки з недоліком статистики для вимірювання середньоквадратичного відхилення на великих часах.

Список літератури

1. Boyden S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leukocytes. J. Exp.Med., 1962, v.115, 453-465.

2. Coates TD et al. Relationship of F-actin distribution to development of polar shape in human polymorphonuclear neutrophils. J. Cell Biol. 1992, v.117, N4, 765-774.

3. Crawford N., Chahal H., Jackson P. The isolation and characterisation of guineapig polymorphonuclear leucocyte actin and myosin. Biochim. et diophis acta, 1980, v.626, N1, 218-233.

4. Harris H. Chemotaxis of granulocytes. J. Pathol. Bacteriol., 1953, v.66, 135-140.

5. Hartman RS, Lau K. The fundamental motor of the human neutrophil is not random: Evidence for local non-Markov movement in neutrophils. Biophys. J., 1994, v.67, 2535-2545.

6. King CA et al. Cell-substrate interactions during amoeboid locomotion of neutrophyl leukocytes., Exp. Cell Res., 1980, v.126, 453-458.

7. Nelson RD, Quie PG Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol., 1975, v.115, 1650-1656.

8. Omann GM et al. Signal transduction and cytoskeletal activation in the neutrophil. Physiol. Rev, 1987, v.67, N1, 285-319.

9. Quie PG, Mills EL, McPhail LC, Johnston RB Phagocytic Defects Springer Semin. Immunopathol 1978, v. 1, 323-337.

10. Repo H. Defects in fagocytic functions. Annals of Clinical

11. Research. 1987, v.19, 263-279.

12. Senda N., Tamura H., Shibata N. The mechanism of the movement of leucocytes. Exp. Cell Res., 1975, v.91, N2, 393-407.

13. Snyderman R., Goetzl EJ Molecular and cellular mechnisms of leukocyte chemotaxis. Scince 1981, v.213, 830-837.

14. Springer TA Adhesion receptors of the immune system. Nature, 1990, v 346, 425-434.

15. Stossel TP On the crawling of animal cells. Science 1993, v.260, 1086-1094.

16. Адо А.Д. Патофізіологія фагоцитів. 1961.

17. Васильєв Ю.М., Гельфанд І.М. Рух і морфогенетичні реакції тканинних клітин в культурі. В зб. Двіж.нем.кл.1977г.

18. Галкін А.А. та співавт. 1994

19. Красовська І.Є. Скоротливі білки нем'язові клітин. I. Актин-і міозіноподобние білки. в сб. Рух нем'язові клітин і їх компонентів. 1977р.

20. Маянскій О.М., Маянскій Д.М. 1989р.

21. Нерсесова Л.С. Рух нем'язові клітин і їх компонентів., Ленінград, «Наука» 1977р.

22. Туманов Є.А. та співавт. Бюлл. Експ. Біол. Мед. 1990, N6, 594-597.

Додаток

Текст програми математичного моделювання випадкового блукання популяції нейтровілов

program neutro;

uses dos, crt, graph;

const

uparrow = # 72;

leftarrow = # 75;

rightarrow = # 77;

downarrow = # 80;

type

gr_descriptor = record

x_0, y_0: word;

X_len, y_len: word;

X_scale, Y_scale: real;

end;

prob_mov = record

max_step: real;

cell_name: string;

step, manual: array [0 .. 10] of real;

cent, cummulate: array [0 .. 10] of word;

end;

scr_mod = (name_edit, arg_edit, fun_edit, diag_edit);

cell_typ = (slow, mean, fast);

par_typ = (g_shift, l_shift, angle);

scr_adr = record

x: integer;

y: integer;

end;

cell_descriptor = record

speed: cell_typ;

x, y, angle: array [1 .. 100] of real;

end;

var

cell: array [1 .. 30] of cell_descriptor;

step_distri: array [g_shift .. angle] of prob_mov;

max_shift: array [1 .. 30] of real;

start_x, start_y, counter: integer;

graph_scale: gr_descriptor;

key: char;

N_line, N_pix_inline: integer;

graph_X, graph_Y: array [slow .. fast] of integer;

marker_place: array [arg_edit .. diag_edit, 1 .. 11] of scr_adr;

name_place, cell_place: scr_adr;

step_len, step_ang, current_x, current_y, current_a: real;

choose_cell: cell_typ;

sign: integer;

procedure draw_axis;

var

i, j: word;

bintext: string;

begin

with graph_scale do

begin

x_0: = round (N_pix_inline/40);

y_0: = round (N_line/40);

X_len: = round (N_pix_InLine-2 * x_0);

Y_len: = round (N_line-2 * y_0);

setlinestyle (0,0,1);

rectangle (x_0, Y_0, x_0 + X_len, Y_0 + Y_len);

end;

end;

procedure opengraph;

var

grdriver, grmode: integer;

begin

detectgraph (grdriver, grmode);

initgraph (grdriver, grmode ,'');

N_line: = getmaxY;

N_pix_inline: = getmaxX;

start_x: = n_pix_inline div 2;

start_y: = n_line div 2;

SetBkColor (Black);

SetColor (LightRed);

cleardevice;

draw_axis;

end;

procedure readscreen (fname: string; Tcl, Tbg: word);

var

x, y, j, txt_b, txt_c: word;

i: array [arg_edit .. diag_edit] of word;

a: char;

d: text;

begin

assign (d, fname);

reset (d);

txt_b: = Black;

TextBackground (txt_b);

clrscr;

y: = 0;

i [arg_edit]: = 0; i [fun_edit]: = 0; i [diag_edit]: = 0;

repeat

y: = y +1; x: = 0;

repeat

x: = x +1;

read (d, a);

case a of

'.' : Begin

if txt_b = Black then txt_b: = Tbg else txt_b: = Black;

txt_c: = Tcl;

textbackground (txt_b);

textcolor (txt_c);

WRITE ('');

end;

'*': Begin

name_place.x: = x;

name_place.y: = y;

write ('');

end;

'$': Begin

cell_place.x: = x;

cell_place.y: = y;

write ('');

end;

'#': Begin

write ('');

i [arg_edit]: = i [arg_edit] +1;

marker_place [arg_edit, i [arg_edit]]. x: = x;

marker_place [arg_edit, i [arg_edit]]. y: = y;

end;

'~': Begin

write ('');

i [fun_edit]: = i [fun_edit] +1;

marker_place [fun_edit, i [fun_edit]]. x: = x;

marker_place [fun_edit, i [fun_edit]]. y: = y;

end;

'!' : Begin

write ('');

i [diag_edit]: = i [diag_edit] +1;

marker_place [diag_edit, i [diag_edit]]. x: = x;

marker_place [diag_edit, i [diag_edit]]. y: = y;

end;

else

write (a);

end;

until eoln (d);

readln (d); writeln;

until eof (d);

close (d);

end;

procedure readreal (var value: real; a: char; len: word; ad: scr_adr);

var LI: array [1 .. 10] of char;

x, y, old: integer;

st: string;

begin

write ('': len);

gotoXY (ad.x, ad.y);

LI [1]: = a; write (a); y: = 2;

if a <> # 13 then

repeat

a: = readkey;

if a = ',' then a :='.';

if ((a = 'O') or (a = 'o')) then a: = '0 ';

if ((a> = 0 ") and (a <= '9 ')) or (a ='.')

then begin LI [y]: = a; write (a); y: = y +1 end;

if a = # 8 then

begin y: = y-1;

gotoXY (ad.x + y-1, ad.y);

write ('');

gotoXY (ad.x + y-1, ad.y);

end;

until a = # 13;

st: = LI [1];

for x: = 2 to y-1 do st: = concat (st, LI [x]);

val (st, value, old);

end;

procedure setmarker (m: scr_mod; i: integer);

begin

gotoxy (marker_place [m, i]. x, marker_place [m, i]. y);

end;

procedure wri_val (x: real; i: integer; old: boolean);

begin

if old

then begin textbackground (Black);

textcolor (LightGray)

end

else begin textbackground (LightGray);

textcolor (Black)

end;

setmarker (fun_edit, i +1);

write ('': 4);

setmarker (fun_edit, i +1);

write (x: 4:1);

setmarker (fun_edit, i +1);

end;

procedure edit_prob (index: par_typ);

var

st: real;

j: integer;

a: char;

begin

with step_distri [index] do

begin

readscreen ('distrib.scr', LightGray, Red);

gotoXY (name_place.x, name_place.y);

case index of

g_shift: write ('Глобальний крок');

l_shift: write ('Локальний крок');

angle: write ('Кут');

end;

st: = max_step/10;

for j: = 0 to 10 do

begin

step [j]: = j * st;

gotoXY (marker_place [arg_edit, j +1]. x, marker_place [arg_edit, j +1]. y);

write (step [j]: 4:1);

gotoXY (marker_place [fun_edit, j +1]. x, marker_place [fun_edit, j +1]. y);

write (manual [j]: 4:1);

end;

j: = 0;

repeat

setmarker (fun_edit, j +1);

wri_val (manual [j], j, false);

setmarker (fun_edit, j +1);

a: = readkey;

if a = # 0 then

begin

a: = readkey;

wri_val (manual [j], j, true);

case a of

rightarrow, downarrow: j: = j +1;

leftarrow, uparrow: j: = j-1;

end;

if j> 10 then j: = 10;

if j <0 then j: = 0;

end;

if ((a> = 0 ") and (a <= '9 ')) or (a ='-')

then

begin

readreal (st, a, 4, marker_place [fun_edit, j +1]);

manual [j]: = st;

end;

until ((a = chr (27)) or (a = ''));

end;

end;

procedure normalize;

var

j: word;

s: par_typ;

x: real;

begin

for s: = g_shift to angle do

begin

x: = 0;

for j: = 0 to 10 do x: = x + step_distri [s]. manual [j];

for j: = 0 to 10 do

begin

step_distri [s]. cent [j]: = round (100 * step_distri [s]. manual [j] / x);

end;

step_distri [s]. cummulate [0]: = step_distri [s]. cent [0];

for j: = 1 to 10 do

begin step_distri [s]. cummulate [j]: =

step_distri [s]. cummulate [j-1] +

step_distri [s]. cent [j];

end;

end;

end;

procedure make_population;

var

i, j, x: word;

begin

clrscr;

for i: = 1 to 30 do

begin

x: = random (100);

j: = 0;

while x> step_distri [g_shift]. cummulate [j] do j: = j +1;

step_len: = step_distri [g_shift]. step [j];

max_shift [i]: = step_len;

cell [i]. x [1]: = 500 + random (1000);

cell [i]. y [1]: = 500 + random (1000);

cell [i]. angle [1]: = random (180);

if random (100) <50 then cell [i]. angle [1]: =- cell [i]. angle [1];

if max_shift [i]> = 15 then cell [i]. speed: = fast;

if (max_shift [i]> = 7) and (max_shift [i] <15) then cell [i]. speed: = mean;

if max_shift [i] <= 7 then cell [i]. speed: = slow;

end;

end;

procedure init;

var

j: word;

s: par_typ;

x: real;

c: cell_typ;

begin

step_distri [g_shift]. max_step: = 30;

step_distri [g_shift]. cell_name: = 'Глобальний';

step_distri [l_shift]. max_step: = 30;

step_distri [l_shift]. cell_name: = 'Локальний';

step_distri [angle]. max_step: = 180;

step_distri [angle]. cell_name: = 'Кути';

s: = g_shift;

for j: = 0 to 10 do step_distri [s]. manual [j]: = 100 * sin (pi * j/10) * sin (pi * j/10);

s: = l_shift;

for j: = 0 to 10 do step_distri [s]. manual [j]: = 100 * sin (pi * j/10) * sin (pi * j/10);

s: = angle;

for j: = 0 to 10 do step_distri [s]. manual [j]: = 100 * exp (-j / 2);

edit_prob (g_shift);

edit_prob (l_shift);

edit_prob (angle);

clrscr;

normalize;

make_population;

end;

procedure calc_step (i: word);

var

x, j: word;

begin

x: = random (100);

j: = 0;

while x> step_distri [l_shift]. cummulate [j] do j: = j +1;

step_len: = step_distri [l_shift]. step [j] * max_shift [i] / 30;

x: = random (100);

j: = 0;

while x> step_distri [angle]. cummulate [j] do j: = j +1;

step_ang: = step_distri [angle]. step [j];

x: = random (100);

if x> 50 then sign: =- 1 else sign: = 1;

end;

procedure make_all_steps;

var i, j: word;

begin

for i: = 1 to 30 do

with cell [i] do

for j: = 2 to 100 do

begin

calc_step (i);

angle [j]: = angle [j-1] + step_ang * sign;

x [j]: = x [j-1] + step_len * cos (angle [j] * pi/180);

y [j]: = y [j-1] + step_len * sin (angle [j] * pi/180);

end;

end;

procedure print_coord;

var i, j, k: word;

f: text;

begin

for i: = 1 to 30 do

with cell [i] do

for j: = 1 to 100 do

begin

writeln (i: 5, x [j]: 9:2, y [j]: 9:2);

if j mod 20 = 0 then readln (k);

end;

end;

procedure speed_meas;

var

i, j: word;

z: real;

shift: array [1 .. 30] of real;

begin

clrscr;

for i: = 1 to 30 do shift [i]: = 0;

for i: = 1 to 30 do

with cell [i] do

for j: = 2 to 100 do

begin

z: = sqrt ((x [j]-x [j-1]) * (x [j]-x [j-1]) + (y [j]-y [j-1]) * (y [ j]-y [j-1]));

shift [i]: = shift [i] + z;

end;

for i: = 1 to 30 do

begin shift [i]: = shift [i] / 100;

end;

end;

procedure write_shift;

var i, j, k: word;

z: real;

shift: array [1 .. 30] of real;

f: text;

begin

assign (f, 'treck.txt');

rewrite (f);

for j: = 1 to 30 do shift [j]: = 0;

j: = 2;

repeat

j: = j +1;

write (f, j: 3);

for i: = 1 to 30 do

with cell [i] do

begin

z: = sqrt ((x [j]-x [j-1]) * (x [j]-x [j-1]) + (y [j]-y [j-1]) * (y [ j]-y [j-1]));

shift [i]: = shift [i] + z;

write (f, shift [i]: 9:2);

end;

writeln (f);

until j = 100;

close (f);

end;

procedure write_angle;

var i, j, k: word;

z: real;

shift: array [1 .. 30] of real;

f: text;

begin

assign (f, 'angle.txt');

rewrite (f);

with step_distri [angle] do

for j: = 0 to 10 do writeln (f, step [j]: 10:2, cent [j]: 10, cummulate [j]: 10);

close (f);

end;

procedure write_disp;

var i, j, k: word;

z: real;

shift, loc_calc: array [1 .. 30] of real;

f: text;

begin

assign (f, 'disper.txt');

rewrite (f);

for j: = 1 to 30 do begin loc_calc [j]: = 0; shift [j]: = 0; end;

j: = 1;

repeat

j: = j +1;

write (f, ln (j): 10:2);

for i: = 1 to 30 do

with cell [i] do

begin

loc_calc [i]: = 0;

for k: = j +1 to 100 do

begin

z: = (x [k]-x [kj]) * (x [k]-x [kj]) + (y [k]-y [kj]) * (y [k]-y [kj]) ;

loc_calc [i]: = loc_calc [i] + z;

end;

shift [i]: = loc_calc [i] / (100-j);

write (f, 0.5 * ln (shift [i]): 10:2);

end;

writeln (f);

until j = 98;

close (f);

end;

procedure write_distr;

var i, j, k: word;

z: word;

shift: array [0 .. 35] of word;

f: text;

begin

assign (f, 'dist_sp.txt');

rewrite (f);

for j: = 0 to 35 do shift [j]: = 0;

for i: = 1 to 30 do

with cell [i] do

begin

for j: = 2 to 100 do

begin

z: = round (sqrt ((x [j]-x [j-1]) * (x [j]-x [j-1]) + (y [j]-y [j-1]) * ( y [j]-y [j-1 ])));

shift [z]: = shift [z] +1;

end;

end;

for j: = 0 to 30 do writeln (f, j: 3, shift [j]: 10);

close (f);

end;

procedure draw_cell (c: cell_typ; x, y: real);

var

color, graph_x, graph_y: integer;

begin

case c of

slow: color: = lightcyan;

mean: color: = yellow;

fast: color: = white;

end;

graph_x: = round (x * n_pix_inline/2000);

graph_y: = round (y * n_line/2000);

putpixel (graph_x, graph_y, color);

end;

procedure draw_picture;

var

i, j: word;

begin

for i: = 1 to 30 do

with cell [i] do

for j: = 1 to 100 do

begin

draw_cell (speed, x [j], y [j]);

end;

end;

begin

randomize;

init;

make_all_steps;

speed_meas;

write_shift;

write_distr;

write_disp;

write_angle;

opengraph;

draw_picture;

key: = readkey;

closegraph;

end.