додати матеріал

приховати рекламу

Методи мікробіологічної діагностики

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

Зміст:
  1. ВСТУП ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 2
  1. Організація лабораторної мікробіологічної служби .. 2
  1. Принципи мікробіологічної діагностики інфекційних захворювань ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 4

  1. Методи виділення та ідентифікації бактерій ... ... ... ... ... ... ... 5
  1. Методи ідентифікації нуклеїнових кислот ... ... ... ... ... ... ... 19
  1. Методи виявлення вірусів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 23
  1. Методи діаностікі грибкових інфекцій ... ... ... ... ... ... ... ... ... .27
  1. Методи виявлення найпростіших ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 29
  1. ВИСНОВОК ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .30
Література ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 31
Введення
Мікробіологічна діагностика в першу чергу необхідна для визначення причини інфекційних захворювань. Існує 5 основних методів лабораторної діагностики: мікроскопічний, бактеріологічний, біологічний, серологічний та алергічний. Їх принципи ми і розглянемо в даному рефераті. Також розглянемо питання організації лабораторної мікробіологічної служби, методи виділення та ідентифікації бактерій, виявлення вірусів, грибів і найпростіших. Дана тема дуже актуальна в наш час, так як з розвитком суспільства і зі збільшенням чисельності населення дедалі масштабнішим стає поширення інфекцій та своєчасне виявлення їх носіїв здатне запобігти виникненню епідемій. Благо зараз біологи вже здатні визначити безліч інфекцій, але, скільки ще не знайдено! А виявлення нових мікроорганізмів, що викликають захворювання, дозволяє своєчасно знайти спосіб лікування. Так що є ще простір для думки і дослідів. Думаю, саме час перейти до вже відомих нам способів розпізнавання мікроорганізмів. Почнемо з місця проведення діагностики: з лабораторій.
ОРГАНІЗАЦІЯ ЛАБОРАТОРНОЇ МІКРОБІОЛОГІЧНОЇ СЛУЖБИ
Об'єкт вивчення медичних мікробіологічних лабораторій - патогенні біологічні агенти (ПБА) - патогенні для людини мікроорганізми (віруси, бактерії, гриби, найпростіші), генно-інженерно модифіковані мікроорганізми, отрути біологічного походження (токсини), гельмінти, а також матеріал (включаючи кров, біологічні рідини і екскременти організму людини), підозрілий на утримання ПБА. У залежності від виконуваних досліджень, мікробіологічні лабораторії поділяють на діагностичні, виробничі та науково-дослідні. Відповідно до типами мікроорганізмів, які вивчаються в них, виділяють бактеріологічні, ві русологіческіе, мікологічні та протозоологіческіе лабораторії. З збудниками інфекційних захворювань робота ють лише в спеціалізованих лабораторіях, забезпечують безпеку її персоналу і неможливість «витоку» патогенних мікроорганізмів за межі лабораторії.

Групи збудників інфекційних захворювань

Регламентація умов роботи зі збудниками інфекційних захворювань здійснено відповідно до ступенем небезпеки мікроорганізмів для людини. За цією ознакою виділено подружжя ре групи збудників.
Група I: збудники особливо небезпечних інфекцій: чума, натуральна віспа, лихоманки Ласса, Ебола і ін
Група II: збудники висококонтагіозна бактеріальних грибкових і вірусних інфекцій: сибірська виразка, холера, лихоманка Скелястих гір, висипний тиф, бластомікоз, сказ та ін У цю групу також включено ботулотоксин (але не сам збудник ботулізму).
Група III: збудники бактеріальних грибкових, вірусних і протозойних інфекцій, виділених в окремі нозологічні форми (збудники коклюшу, правця, ботулізму, туберкульозу, кандидозу, малярії, лейшманіозу, грипу, поліомієліту та ін.) У цю групу також включені аттенуіровані штами бактерій груп I, II і III.
Група IV: збудники бактеріальних, вірусних, грибкових септицемії, менінгітів, пневмоній, ентеритів, токсикоінфекцій та гострих отруєнь (збудники анаеробних газових інфекцій, синьогнійної інфекції, аспергильоза, амебіазу, аденовіруси, герпесвіруси та ін.)

Лабораторії різних груп ризику

У залежності від рівня безпеки роботи з мікроорганізмами лабораторії поділяють на чотири групи ризику.
Перша група ризику: лабораторії особливого режиму (максимально ізольовані) з високим індивідуальним і суспільним ризиком.
Друга група ризику: режимні лабораторії (ізольовані) з високим індивідуальним і низьким громадським ризиком.
Третя група ризику: базові (основні) лабораторії з помірним індивідуальним і обмеженим громадським ризиком.
Четверта група ризику: базові (основні) лабораторії з низьким індивідуальним і суспільним ризиком.

Бактеріологічні лабораторії

У системі Міністерства охорони здоров'я та Державного комітету санітарно-епідеміологічного нагляду РФ найбільш розгалужена мережа бактеріологічних лабораторій. Відповідно до виконуваних завдань виділяють:
• бактеріологічні лабораторії в складі ЛПУ;
• бактеріологічні лабораторії в складі комітетів Держсанепіднагляду;
• навчальні бактеріологічні лабораторії вузів;
• проблемні і галузеві бактеріологічні лабораторії науково-дослідних інститутів та підприємств із випуску бактерійних препаратів;
• спеціалізовані бактеріологічні лабораторії з контролю за особливо небезпечними інфекціями;
• спеціалізовані бактеріологічні лабораторії з контролю за окремими групами бактерій: мікобактеріями, рикетсіями, лептоспірозом та ін
Велика частина мікробіологічних лабораторій працює з БПА груп III і IV, а вивченням збудників особливо небезпечних інфекцій (групи I і II) займаються тільки спеціалізовані рова лабораторії.
Вимоги до організації роботи з БПА груп небезпеки III і IV
Базові лабораторії, що працюють з БПА груп III і IV, повинні розташовуватися в окремому будинку або в ізольованій частині будівлі. Вони повинні мати два виходи: один для співробітників, інший - для доставки матеріалів для досліджень (допускається передача матеріалу через передавальне вікно). У лабораторіях вузів, науково-дослідних інститутів і на підприємствах по випуску бактерійних препаратів допускається наявність одного входу. Лабораторії повинні мати необхідний набір приміщень у відповідності з виробничою потужністю і номенклатурою виконуваних досліджень. У них повинні бути проведені водопровід, електрика, опалення та вентиляція. У системі водопостачання повинні бути передбачені роздільні мережі подачі води для лабораторних досліджень і побутових потреб (мережа питної води). Остання повинна бути захищена від зворотного струму води з лабораторної мережі. Вентиляція повинна бути припливно-витяжної, при цьому найбільш низький тиск витяжної вентиляції повинно бути в приміщеннях з найбільшою небезпекою інфікування. При необхідності вентиляцію слід оснастити фільтрами тонкого очищення повітря. Приміщення повинні мати природне і штучне освітлення. Кожна лабораторія повинна мати «чисту» та «брудну» зони. Їхнє планування і розміщення обладнання повинні забезпечувати «проточність>> просування ПБА по« брудної »зоні.
«Брудна» зона включає приміщення для прийому та реєстрації матеріалу, бокси та кімнати для проведення мікробіологічних досліджень, приміщення для проведення серологічних досліджень, кімната для проведення люмінесцентної мікроскопії, термостатна, автоклавної для знезараження матеріалу. Вікна та двері всіх приміщень повинні герметично закриватися. Припливно-витяжна вентиляція «брудної» зони повинна бути обладнана фільтрами тонкої очищення повітря, що викидається. Приміщення для проведення робіт з живими ПБА повинні бути обладнані бактерицидними лампами. Обов'язкова маркування автоклавів, столів, стелажів для чистого і інфікованого матеріалу. Покриття лабораторних меблів, поверхні підлоги, стін і стелі повинні бути гладкими і стійкими до дії миючих і дезінфікуючих засобів.
«Чиста» зона включає гардероб для верхнього одягу, кімнати відпочинку, кімнату для роботи з документацією, кімнату для надягання робочого одягу, підсобні приміщення, душову, туалет, приміщення для попередніх робіт (препараторська, мийна, кімната для приготування та розливу поживних середовищ і ін ), стерилізаційну, приміщення з холодильниками для зберігання поживних середовищ та діагностичних препаратів. У «чистої» зоні можлива робота з неживими ПБА (серологічні та біохімічні дослідження).
Вимоги до проведення робіт у мікробіологічній лабораторії
Роботу з БПА груп III і IV виконують фахівці з вищою та середньою спеціальною освітою. До неї допускають співробітників, які пройшли інструктаж щодо дотримання вимог безпеки праці з БПА; наступний інструктаж слід проводити не рідше одного разу на рік. Всі співробітники, що працюють з БПА, повинні перебувати на диспансерному обліку. Прилади, обладнання та засоби вимірювання мають бути атестовані, технічно справні і мати технічний паспорт. Їх метрологічний контроль і технічний огляд слід проводити у встановлені терміни.
З правил роботи в «брудної зоні» базової лабораторії:
Використання спецодягу та засобів індивідуального захисту. Перед роботою слід перевірити якість посуду, піпеток, шприців та іншого обладнання. При піпетування необхідно користуватися тільки гумовими грушами або автоматичними пристроями. Суворо заборонено піпетувати матеріал ротом, переливати його через край посудини (пробірки, колби), а також залишати без нагляду робоче місце під час виконання будь-яких робіт з БПА. У брудній зоні забороняється палити, пити воду, зберігати верхній одяг, головні убори, взуття, харчові продукти. У приміщення зони не можна приводити дітей і домашніх тварин.
Після закінчення роботи всі об'єкти, що містять ПБА, повинні бути прибрані у сховища (холодильники, термостати, шафи) з обов'язковою дезінфекцією столів. Використані піпетки повністю (вертикально) занурюють у дезінфікуючий розчин, уникаючи утворення пухирців у каналах. Залишки ПБА, використаний посуд та обладнання збирають у закриваються ємності і передають до автоклавної. Категорично заборонено зливати відходи з БПА в каналізацію без попереднього знезараження. Після закінчення роботи з БПА і зараженими тваринами, а також після відходу з лабораторії слід ретельно вимити руки.
ПРИНЦИПИ МІКРОБІОЛОГІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ ІНФЕКЦІЙНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ
Мета мікробіологічних досліджень - встановити факт наявності або відсутності збудника в організмі хворого і на об'єктах навколишнього середовища.
Завдання мікробіологічних досліджень - ідентифікувати мікроорганізми в досліджуваному матеріалі, визначити їх видову приналежність, морфологічні, біохімічні, токсигенні та антигенні властивості, а також встановити чутливість виділених мікроорганізмів до антимікробних препаратів. Незважаючи на те, що проведення мікробіологічних досліджень належить до компетенції мікробіологів, кожен лікар, що має справу з інфекційними захворюваннями, повинен знати, як і коли необхідно відбирати матеріал для досліджень, на які дослідження його направляти і як інтерпретувати отримані результати.
Відбір матеріалу.
Перший етап будь-якого мікробіологічного дослідження становить правильний вибір матеріалу для дослідження. Його визначають властивості збудника і патогенез викликається ним захворювання. При ураженнях окремих органів і систем доцільно відбирати матеріал відповідної локалізації. При відсутності поразок досліджують кров, а потім відбирають зразки з урахуванням клінічної картини захворювання і доступності матеріалу для дослідження. Так, при лихоманці неясного генезу спочатку проводять посів крові; потім, при появі симптомів більш конкретних проявів, наприклад пневмонії, проводять забір мокроти.
Зразки слід забирати до призначення антимікробної терапії, з дотриманням правил асептики для попередження забруднення матеріалу. Кожен зразок слід розглядати як потенційно небезпечний. При заборі, транспортуванні, зберіганні та роботі з ним необхідно дотримувати правила біологічної безпеки. Матеріал збирають в обсязі достатньому для всього комплексу досліджень. Мікробіологічні дослідження слід починати негайно після надходження зразка в лабораторію.
Вибір матеріалу для дослідження повинен відповідати характеру інфекційного процесу. Так, наприклад, при встановленні етіології пневмонії матеріалом повинна бути мокротиння, а не слина, а при ранових інфекціях відокремлюване слід забирати з глибини рани, а не з її поверхні.

Вибір лабораторних досліджень

Основу мікробіологічної діагностики інфекційних захворювань складають мікроскопічні, мікробіологічні, біологічні, серологічні та алергологічні методи.
Мікроскопічні методи
Мікроскопічні методи включають приготування мазків і препаратів для микроскопирования. У більшості випадків результати мікроскопічних досліджень носить ориенти ровочной характер (наприклад, визначають ставлення збудників до фарбування), так як багато мікроорганізмів позбавлені морфологічних і тинкторіальних особливостей. Тим не менш мікроскопією матеріалу можна визначити деякі морфологічні ознаки збудників (наявність ядер, джгутиків, внутрішньоклітинних включень і т.д.), а також встановити факт наявності або відсутності мікроорганізмів в надісланих зразках.
Мікробіологічні методи
Мікробіологічні методи - «золотий стандарт» мікробіологічної діагностики, так як результати мікробіологічних досліджень дозволяють точно встановити факт наяв ності збудника в досліджуваному матеріалі. Ідентифікацію чистих культур (до виду мікроорганізму) проводять з урахуванням морфологічних, тинкторіальних, культуральних, біохімічних, токсигенних і антигенних властивостей мікроорганізму . Більшість досліджень включає визначення чутливості до антимікробних препаратів у виділеного збудника. Для епідеміологічної оцінки ролі мікроорганізму проводять внутрішньовидову ідентифікацію визначенням фаговаров, біовару, резістентваров і т.д.
Біологічні методи
Біологічні методи спрямовані на визначення наявності токсинів збудника в досліджуваному матеріалі і на виявлення збудника (особливо при незначному вихідному вмісті в досліджуваному зразку). Методи включають зараження лабораторних тварин досліджуваним матеріалом з наступним виділенням чистої культури патогена, або встановленням факту присутності мікробного токсину та його природи. Моделювання експериментальних інфекцій у чутливих тварин - важливий інструмент вивчення патогенезу захворювання і характеру взаємодій всередині системи мікроорганізм-макроорганізм. Для проведення біологічних проб використовують тільки здорових тварин певних маси тіла і віку. Інфекційний матеріал вводять всередину, в дихальні шляхи, внутрішньочеревно, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрішньошкірно і підшкірно, в передню камеру ока, через трепанаціонное отвір черепа, субокціпітально (у більшу цистерну головного мозку). У тварин прижиттєво забирають кров, ексудат з очеревини, після загибелі - кров, шматочки різних органон, СМЖ, ексудат з різних порожнин.
Серологічні методи
Серологічні методи виявлення специфічних АТ і Аг збудника - важливий інструмент у діагностиці інфекційних захворювань. Особливу цінність вони мають у тих випадках, коли виділити збудник не представляється можливості. При цьому необхідно виявити підвищення титрів АТ, у зв'язку з чим досліджують парні зразки сироватки, взяті в інтервалі 10-20 діб (іноді цей інтервал може бути більш тривалим). АТ зазвичай з'являються в крові на 1-2-й тиждень захворювання і циркулюють в організмі відносно довго, що дозволяє використовувати їх виявлення для ретроспективних епідеміологічних досліджень. Визначення класів lg чітко характеризує етапи інфекційного процесу, а також може бути непрямим прогностичним критерієм. Особливе значення мають методи виявлення мікробних Аг. У значущих кількостях вони з'являються вже на самих ранніх термінах, що робить їх ідентифікацію важливим інструментом експрес-діагностики інфекційних захворювань, а кількісне їх визначення в динаміці інфекційного процесу служить критерієм ефективності проведеної антимікробної терапії.
Алергологічні методи
Аг багатьох збудників володіють сенсибілізірующим дією, що використовують для діагностики інфекційних захворювань, а також при проведенні епідеміологічних досліджень. Найбільшого поширення знайшли шкірно-алергічні проби, які включають внутрішньошкірне введення Аг (алергену) з розвитком реакції ГЗТ. Шкірні проби знайшли застосування в діаностіке таких захворювань як сап, меліодіоз, бруцельоз. Найбільш відома проба Манту. Використовувана як для діагностики туберкульозу, так і для оцінки несприйнятливості організму до збудника.
МЕТОДИ ВИДІЛЕННЯ І ІДЕНТИФІКАЦІЇ БАКТЕРІЙ
Мікроскопія матеріалу
Будь-яке бактеріологічне дослідження починається з мікроскопії матеріалу і його подальшого посіву на живильні середовища. Ефективність виділення збудника в значній мірі обумовлена ​​правильною технікою відбору зразків клінічного матеріалу, своєчасністю їх доставки в лабораторію і правильним зберіганням зразків.
Світлооптичному МІКРОСКОПІЯ
Для світлової мікроскопії застосовують мікроскоп - оптичний прилад, що дозволяє спостерігати дрібні об'єкти (рис. 1-1). Збільшення зображення досягають системою лінз конденсора, об'єктива і окуляра. Конденсор, розташований між джерелом світла і досліджуваним об'єктом, збирає промені світла в полі мікроскопа. Об'єктив створює зображення поля мікроскопа всередині тубуса. Окуляр збільшує це образ і робить можливим його сприйняття оком. Межа дозволу мікроскопа (мінімальна відстань, на якому помітні два об'єкти) визначається довжиною світлової хвилі і апертурою лінз. Теоретично можлива межа дозволу світлового мікроскопа дорівнює 0,2 мкм; реальний дозвіл можна підвищити за рахунок збільшення апертури оптичної системи, наприклад шляхом збільшення коефіцієнта заломлення. Коефіцієнт заломлення (імерсії) рідких середовищ більше коефіцієнта заломлення повітря («= 1,0), при мікроскопірованіі застосовують декілька імерсійним середовищ: масляну, гліцеринову, водну. Механічна частина мікроскопа включає штатив, предметний столик, макро-і мікрометричний гвинти, тубус, тубусодержатель.
Темнопольна мікроскопія дозволяє спостерігати живі бактерії. Для цього використовують темнопольний конденсор, що виділяє контрастують структури незабарвленого матеріалу. Перед початком роботи світло встановлюють і центрують по світлому полю, потім светлопольний конденсор видаляють і замінюють відповідною системою (наприклад, ОІ-10 або ОІ-21). Препарат готують за методом «роздавленої краплі», роблячи його як можна більш тонким (товщина покривного скла не повинна бути товщі за 1 мм). Спостережуваний об'єкт виглядає як освітлений на темному полі. При цьому промені від освітлювача падають на об'єкт збоку, а в лінзи мікроскопа надходять тільки розсіяні промені (рис. 1-2). Як імерсійної рідини придатне вазелінове масло.
Фазово-контрастна мікроскопія дозволяє вивчати живі і нефарбовані об'єкти за рахунок підвищення їх контрастності. При проходженні світла через забарвлені об'єкти відбувається зміна амплітуди світлової хвилі, а при проходженні через незабарвлені - фази світлової хвилі, що використовують для отримання висококонтрастного зображення у фазово-контрастної (рис. 1-3) та інтерференційної мікроскопії. Для підвищення контрастності фазові кільця покривають металом, що поглинає пряме світло, не впливаючи на зсув фази. В оптичній системі мікроскопа застосовують спеціальний конденсор з револьвером діафрагм і центрувальним пристроєм; об'єктиви замінюють на імерсійним об'єктиви-апохромати.
Поляризаційна мікроскопія дозволяє отримувати зображення нефарбованих анізотропних структур (наприклад, колагенових волокон, міофібрил або клітин мікроорганізмів). Принцип методу заснований на вивченні об'єкта у світлі, утвореному двома променями, поляризованими у взаємно перпендикулярних площинах.
Інтерференційна мікроскопія поєднує принципи фазово-контрастної і поляризаційної мікроскопії. Метод застосовують для отримання контрастного тривимірного зображення нефарбованих об'єктів. Принцип методу заснований на роздвоєнні світлового потоку в мікроскопі; один промінь проходить через об'єкт, інший - повз нього. Обидва промені з'єднуються в окулярі і інтерферують між собою.
Люмінесцентна мікроскопія. Метод заснований на здатності деяких речовин світитися при дії короткохвильового випромінювання. При цьому випускаються світлові хвилі довше хвилі, що викликає світіння. Іншими словами, флюоресцирующим об'єкти поглинають світло однієї довжини хвилі і випромінюють в іншій області спектра (рис. 1-4). Наприклад, якщо індукуюча випромінювання синє, то утворюється світіння може бути червоним або жовтим. Ці речовини (флюоресцеіна ізоціанатів, акридинового помаранчевий, родамін та ін) використовують як флюоресцирующим барвники для спостереження флюоресцирующих (люмінесцирующих) об'єктів. У люмінесцентному мікроскопі світло від джерела (ртутна лампа надвисокого тиску) проходить через два фільтри. Перший ( синій) фільтр затримує світло перед зразком і пропускає світло довжини хвилі, збудливою флюоресценцію зразка. Другий (жовтий) затримує синє світло, але пропускає жовтий, червоний, зелений світло, випромінюваний флюоресцирующим об'єктом і сприймається оком. Зазвичай досліджувані мікроорганізми забарвлюють безпосередньо або за допомогою AT або лектинів, помічених флюорохромами. Препарати взаємодіють з Аг або іншими зв'язуючими ліганд структурами об'єкта. Люмінесцентна мікроскопія знайшла широке застосування для візуалізації результатів імунохімічних реакцій, заснованих на специфічному взаємодії мічених флюоресцентними барвниками AT з Аг досліджуваного об'єкта. Варіанти I імунофлюоресцентний реакцій представлені рис. 1-5 і 1-6.

Рис. 1-3. Схема фазово-контрастного
мікроскопа


Електронна мікроскопія
Теоретично дозвіл просвічує електронного мікроскопа складає 0,002 нм; реальне, дозвіл сучасних мікроскопів наближається до 0,1 нм. На практиці дозвіл для біологічних об'єктів досягає 2 нм.
Що просвічує електронний мікроскоп
(Рис. 1-7) складається з колони, через яку у вакуумі проходять електрони, випромінювані катодного ниткою. Пучок електронів, фокусируемого кільцевими магнітами, проходить через підготовлений зразок. Характер розсіювання електронів залежить від щільності зразка. Проходять через зразок електрони спостерігають на флюоресцирующей екрані і реєструють за допомогою фотопластинки.
Скануючий електронний мікроскоп застосовують для одержання тривимірного зображення поверхні досліджуваного об'єкта.
Підготовка матеріалу до мікроскопії
У бактеріологічній практиці мікроскопічно досліджують незабарвлені зразки (нативний матеріал) і пофарбовані препарати (мазки або мазки-відбитки), приготовлені з клінічного матеріалу або колоній виросли мікроорганізмів.
Нативні препарати
Нативні препарати готують для дослідження живих нефарбованих бактерій. Найбільшого поширення набули метод висячої краплі, мікрокамери з щільними середовищами та негативні методи дослідження живих бактерій. Для прижиттєвого дослідження також часто застосовуються дослідження в темному полі і фазово-контрас тна мікроскопія. Подібні прийоми часто використовують для діагностики сифілісу і попередньої діагностики діарей, викликаних кампілобактерами, а також для визначення рухливості мікроорганізмів.
Пофарбований препарати
Для приготування забарвлених препаратів з досліджуваного об'єкта готують мазки і фіксують їх.
Відбір матеріалу. Тампони, що містять мікроорганізми, прокочують по предметному склу (рис. 1-8, А); з їх допомогою також готують мазки з непрозорих рідин, наприклад суспензії випорожнень (рис. 1-8, Б). Мазки з матеріалів зі слизової або грубої консистенцією готують розтиранням їх між двома предметними скельцями (рис. 1-9). Прозорі рідини (наприклад, сечу або спинномозкову рідину) можна нанести у вигляді краплі на предметне скло (рис. 1-10, А), при цьому межі краплі бажано обвести маркером. Кращі результати дає попереднє центрифугування; потім осад наносять на скло; якщо він густий, його можна розподілити за допомогою скляної палички (мал. 1-10, Б).
Фіксація. У практичній бактеріології найбільш поширена термічна фіксація (над полум'ям пальника) - метод грубий, але зберігає морфологію і ставлення до барвників у бактерій. Для більш детального вивчення структури клітин застосовують фіксуючі розчини, що запобігають ферментативний аутоліз бактерій і стабілізуючі макромолекули шляхом хімічного їх зшивання. Для світлооптичної мікроскопії використовують формалін, спирти, глутаральдегід, рідина Карнуа, ацетон, пари осмієва кислоти та ін Мазки фіксують, поміщаючи їх у розчин фіксатора або завдаючи фіксаж на мазок. Для електронної мікроскопії застосовують глутаральдегід і тетраоксід осмію.
Фарбування. Стандартні барвники, використовувані для забарвлення бактерій, - карболовий фуксин Ціля, фуксин Пфайф-фера і метиленовий синій по Леффлера. Для отримання більш інформативних результатів у світлооптичної мікроскопії використовують спеціальні та диференційні методи забарвлення.







Спеціальні методи фарбування бактерій. Найбільшого поширення знайшли методи Грама і Ціля-Нільсена (рис. 1-11).                                                                                                               
Диференційні методи зазвичай застосовують для фарбування різних морфологічних структур.
Капсули. Для фарбування капсул бактерій застосовують методи Хісса, Лейфсона і Антоні; останній метод найбільш простий і включає забарвлення кристалічним фіолетовим з подальшою обробкою 20% водним розчином CuSO 4.
Джгутики. Для забарвлення джгутиків запропоновані методи Леффлера, Бейлі, Грея та ін Для цих методів характерні початкове протруювання препарату [зазвичай розчинами таніну, KAl (SO 4) 2, HgCl 2] і подальша забарвлення (частіше карболовий фуксин Циля).
Спори. Забарвлення спор бактерій проводять після попередньої обробки їх стінок. Найбільш простий метод Пєшкова, що включає кип'ятіння мазка з синькою Леффлера на предметному склі з подальшою докраской нейтральним червоним. Спори забарвлюються в синій колір, вегетативні клітини - в рожевий.
Живильні середовища для культивування бактерій
Для виділення чистих культур патогенних бактерій застосовують оптимальні для їхнього росту поживні середовища з фіксованим рН. Більшість бактерій здатне рости на різних поживних середовищах; виняток становлять хламідії і рикетсії, не зростаючі in vitro поза клітинних культур. Використовувана середовище повинне містити

-
речовини, відходи, бактеріями для різних біосинтетичних процесів.
Універсальні джерела азоту і вуглецю - бел-ковие гідролізати (містять повний набір амінокіс-лот), пептиди і пептони. Універсальні джерела
вітамінів і мікроелементів - екстракти білків жи-
Вотня або рослинного походження і білкові гідролізати.
рН середовища. У деяких випадках життєдіяльність
бактерій супроводжується зрушенням рН у кислу або
лужну сторону, що вимагає внесення до середовища раз-
особистих буферних систем (зазвичай застосовують фосфат-
ний буфер). Збалансовані середовища відрізняють висо-
кая буферність і стабільний оптимум рН. Важливо так
ж створення оптимальної концентрації О 2 і СО 2. ;
Класифікації середовищ
Середовища класифікують по консистенції, складу, походженням, призначенням та забрудненості матеріалу.
За консистенцією поживні середовища поділяють на щільні (тверді), напіврідкі і рідкі.
По складу виділяють білкові, безбілкові і ми мінерали середовища.
За походженням середовища поділяють на штучні та природні (природні).
Штучні середовища поділяють на тваринні [наприклад, мясопептонний агар (МПА) або мясопептонний бульйон (МПБ)] і рослинні (наприклад, настої сіна і соломи, відвари злаків, дріжджів або фруктів, пивне сусло та ін.)









Природні середовища можуть містити компоненти тваринного (наприклад, кров, сироватка, жовч) або рослинного (наприклад, шматочки овочів і фруктів) походження.
  За призначенням виділяють консервуючі середовища (для первинного посіву і транспортування), середовища збагачення (для накопичення певної групи бактерій), середовища для культивує вання (універсальні прості, складні спеціальні і для токсиноутворення), середовища для виділення та накопичення (консервуючі, збагачення і елективні) і середовища для ідентифікації (диференціальні і елективної-диференціальні).
По забруднення матеріалу. Якщо матеріал слабо забруднене сторонньої мікрофлорою, то для виділення чистих культур застосовують прості (за складом) середовища. При рясній контамінації сапрофіти використовують спеціальні або елективні (для окремих видів), селективні тивні (тільки для окремих бактерій), диференційно-діагностичні (для полегшення ідентифікації ) середовища.
Характеристики середовищ
Консервуючі середовища попереджають відмирання патогенів і пригнічують зростання сапрофітів. Найбільше застосування знайшли гліцеринова суміш (середа Тіга), гіпертонічний розчин, гліцериновий консервант з LiCl 2, розчин цитрату натрію і дезоксихолатом натрію (середа Бенгсанга-Еліота).
Середовища збагачення (наприклад, середовище Китта-Тароцці, селенітовий бульйон, тіогліколятная середа) застосовують для накопичення певної групи бактерій за рахунок створення умов, оптимальних для одних видів і несприятливих для інших. Найбільш часто в якості подібних агентів використовують різні фарбники і хімічні речовини - солі жовчних кислот, тетратионат Na +, телуру К +, антибіотики, фуксин, генциановий фіолетовий, діамантовий зелений та ін
Елективні та селективні середовища (наприклад, середовища Уйлсона-Блера, Ендо, Плбскірева, Мак-Конки) призначені для первинного посіву матеріалу або для пересіву з консервуючих середовищ або середовищ збагачення з метою одержання чистої культури. Середовища готують з урахуванням біохімічних та енергетичних потреб мікроорганізмів. Відповідно, виділяють кров'яні та сироваткові середовища (наприклад, Леффлера, Борде-Жангу), яєчні середовища (наприклад, Левенштайна-Йенсена) та ін

Диференційно-діагностичні середовища (наприклад, середовища Хісса, Кларка) застосовують для вивчення та ідентифікації окремих типів, видів і груп бактерій. В якості основи застосовують різні органічні і неорганічні сполуки, гідролізати казеїну, пептонную воду, бульйон Хоттингера-Мартена, доповнені вуглеводами, спиртами, сечовиною та іншими речовинами; при їхньому розщепленні відбувається зсув рН в кислу (вуглеводи, спирти, ліпіли) або лужну (білки ) сторону. Відповідно, виділяють середовища з вуглеводами і спир тами, середовища з сечовиною, середовища для визначення індолообразованія, середовища для визначення протеолітичної активності і комбіновані (Політропний) середовища. У такі середовища також часто вносять різні індикатори (наприклад, бромтимоловий синій, індикатор Андраде, бромкрезоловим пурпурний і крезоловий червоний), що допомагають візуально визначити зміну рН, характерне для різних мікроорганізмів. Зокрема, зрушення в кислу сторону викликає почервоніння середовища з реактивом Андраде або пожовтіння при використанні середовища з бромтимолового синім, тоді як при защелачивании реактив Андраде і індикатор бром-тимолової синій не міняють колір середовища. Всі диференційно-діагностичні середовища поділяють на чотири основні групи.
Середовища, що містять білки, що дають характерні зміни під дією бактеріальних ферментів (кров, желатину, молоко та ін), застосовують для визначення гемолітичних або протеолітичних властивостей. Найбільш поширені мясопептонном желатину (МПЖ), що згорнулася кінська сироватка, молоко і кров'яний агар (КА).
Середовища, що містять вуглеводи або багатоатомні спирти. Ферментативне розщеплення субстратів приводить до зрушення рН і зміни забарвлення середовища, а іноді і утворення газу. Найбільш поширені кольорові середовища з різними вуглеводами (наприклад, з бром-тимолова синім, індикатором ВР), лакмусовим молоко (середа Минкевича) і середовища Хісса. З вуглеводів найбільш часто використовують моносахариди (ксилозу, арабінозу, глюкозу, фруктозу, манозу, галактозу), дисахариди (лактозу, мальтозу, сахарозу), полісахарі ди (крохмаль, глікоген, інулін, декстрин), спирти (дульцит, маніт, сорбіт, гліцерин ) і глікозиди (Адонія, інозит, саліцин, амігдалин).
Середовища для визначення редукуючої здібності. У цю групу входять середовища з фарбами, знебарвлюються при відновленні (наприклад, метиленовий блакитний, нейтральний червоний, індигокармін), а також середовища з нітратами для визначення денітрифікуючі активності бактерій (при позитивному результаті середовища забарвлюються в синій колір).
Середовища, що включають речовини, асимільовані тільки певною групою бактерій. Найбільш відомі цитратний агар Сіммонса і цитратно середу Козера.
Посів і культивування
При достатній вміст патогенних бактерій в зразку проводять посів на щільні живильні середовища (для одержання ізольованих колоній). Якщо в досліджуваному матеріалі бактерій мало, то посів проводять на рідкі середовища збагачення. На практиці виділення щодо невибагливих бактерій зазвичай проводять на простих середовищах (наприклад, на КА, агарі Плоскірєва, тиогликолевой бульйоні, агарі Сабуро і т.д.). Для виділення вибагливих видів в середовища вносять поживні речовини (кров, сироватку, дріжджовий екстракт і ін), а також поглинутої зразка очисники токсичних метаболітів, що утворюються при зростанні бактерій (наприклад, деревне вугілля). Для посівів застосовують мікробіологічні петлі, рідше голки і шпателі.
Отримання ізольованих колоній
Для отримання ізольованих колоній на практиці найбільш часто використовують модифікацію розсіву по Дрігальского. Для цього матеріал наносять на поверхню щільного живильного середовища ближче до краю і роблять «бляшку». Потім з неї матеріал розподіляють по чотирьох квадратах, проводячи петлею штрихи, як показано на рис. 1-12, обпікаючи петлю після засіву кожного квадрата. Подібний метод дозволяє отримати ізольовані колонії і вивчати їх. Виняток становить техніка посіву при бактеріологічному дослідженні сечі (техніка штрихового засіву показана на рис. 1-13). Зазначені методи придатні для посіву аеробних і факультативно анаеробних бактерій, а також несуворих анаеробів.
Температура культивування
Патогенні бактерії варіабельні щодо температур, оптимальних для їх росту, але більшість з них непогано розвивається при 35-37 ° С. Виняток становлять деякі атипові мікобактерії, збудник чуми, лістерії і лептоспіри (температурний оптимум 20-30 ° С), а також Campylobacter jejuni (Температурний оптимум 42 ° С).

.
Склад газового середовища
Бактерії чітко розділяють по відношенню до вмісту кисню в атмосфері культивування.
Аероби. Посіви аеробних бактерій культивують у простих термостатах. Деякі факультативно анаеробні види також можна культивувати при атмосферному повітрі, але більш оптимально приміщення посівів у термостати з дозованою подачею кисню. На практиці їх частіше поміщають в ексикаторі, куди вносять палаючу свічку; після її вигоряння в атмосфері знижується вміст кисню і підвищується вміст СО 2.
Анаероби. Посіви анаеробних бактерій в рідких середовищах заливають вазеліновим або іншим маслом. При використанні щільних середовищ посіви культивують у спеціальних пристроях - анаеростатах (звідки відкачують повітря) або заливають посіви тонким шаром агару. Анаеробні умови можна створити хімічним шляхом, помістивши посіви в ексикаторі, на дно яких заливають лужний розчин пірогалолу, що поглинає кисень. Також можна використовувати методи Фортнера, Цейсслера і Вейнберга.
Метод Фортнера. Посіви проводять на чашку Петрі з товстим шаром середовища, розділеним навпіл вузької канавкою, вирізаної в агарі. На одну половину засівають культуру аеробних бактерій, на іншу - анаеробних. Краї чашки заливають парафіном і інкубують в термостаті. Спочатку спостерігають зростання аеробів, а потім (після поглинання кисню) - зростання анаеробів.
Метод Цейсслера використовують для виділення чистих культур спороутворюючих анаеробів. Для цього проводять посів на середу Китта-Тароцці, прогрівають 15 хв при 80 ° С (для знищення вегетативних форм), заливають вазеліновим маслом і інкубують 24 год Потім проводять посів на цукрово-кров'яний агар для отримання чистих культур. Після 24-годинного культивування підозрілі колонії вивчають і відсівати на середу Китта-Тароцці (з подальшим контролем чистоти виділеної культури).
Метод Вейнберга використовують для отримання чистих культур строгих анаеробів. Культури, вирощені на середовищі Китта-Тароцці, вносять в цукровий бульйон. Потім пастерівською піпеткою з запаяним кінцем матеріал переносять у вузькі пробірки (трубки Віньяля) з цукровим МПА, занурюючи пастерку до дна пробірки. Засіяні пробірки швидко охолоджують холодною водою, що дозволяє зафіксувати окремі бактеріальні клітини в товщі затверділого агару. Пробірки інкубують, і вивчають виросли колонії. При виявленні підозрілої колонії на її місці роблять розпил, колонію швидко відбирають і засівають на середу Китта-Тароцці (з подальшим контролем чистоти виділеної культури).
1


          Методи культивування
При вирощуванні бактерій застосовують стаціонарний спосіб, спосіб глибинного культивування з аерацією і метод проточних поживних середовищ. У відповідності зі способами вирощування бактеріальні культури поділяють на періодичні (при стаціонарному та глибинному культивуванні) і безперервні (при проточному культивуванні).
Стаціонарний спосіб - найбільш часто використовуваний на практиці. Склад середовищ залишається постійним, з ними не проводять жодних додаткових маніпуляцій.  
Спосіб глибинного культивування застосовують при промисловому вирощуванні бактеріальної біомаси, для чого використовують спеціальні котли-реактори. Вони забезпечені системами підтримки температури, подачі в бульйон різних поживних речовин, перемішування біомаси та постійної подачі кисню. Створення аеробних умов по всій товщі середовища сприяє протіканню енергетичних процесів по аеробному шляху, що сприяє максимальної утилізації енергетичного потенціалу глюкози і, отже, максимальному виходу біомаси.
Метод проточних середовищ (промисловий спосіб культивування) дозволяє постійно підтримувати бактеріальну культуру в експоненційної фазі росту, що досягають постійним внесенням поживних речовин і видаленням певного числа бактеріальних клітин. Перебування бактерій у експоненційної стадії росту забезпечує максимальний вихід різних БАР (вітаміни, антибіотики та ін.)
Первинна ідентифікація бактерій
У більшості випадків вивчення особливостей росту для первинної ідентифікації збудників проводять на колоніях, що виросли протягом 18-24 ч. Характер росту бактерій на різних середовищах може дати багато корисної інформації. На практиці використовують порівняно невеликий набір критеріїв. У рідких середовищах зазвичай враховують характер поверхневого (утворення плівки) або придонного зростання (вид осаду) і загальне помутніння середовища. На твердих середовищах бактерії формують колонії - ізольовані структури, які утворюються в ре док зростання і накопичення бактерій. Колонії виникають як наслідок зростання і розмноження однієї або декількох клітин. Таким чином, пересівши з колонії в подальшому дає можливість оперувати з чистою культурою збудника. Зростання бактерій на щільних середовищах має більше характерних особливостей.
Гемоліз
Деякі бактерії виділяють гемолізіни - речовини, що руйнують еритроцити. На КА їх колонії оточують зони просвітління. Освіта гемолізинів (і відповідно - розміри зон гемолізу) може бути варіабільним, і для адекватного визначення гемолітичної активності слід переглядати чашки з посівами проти джерела світла (рис. 1-14). Активність гемолізинів може виявлятися в повному або неповному руйнуванні еритроцитів.
α-Гемоліз. Руйнування еритроцитів може бути неповним, зі збереженням клітинної строми. Подібний феномен називають α-гемоліз. Просвітлення середовища навколо колоній зазвичай трохи, пізніше середовище навколо колоній може набувати зеленувате забарвлення. Подібний зростання характерне для пневмокока, а також для групи так званих зеленять стрептококів.
β-Гемоліз. Набагато велика група бактерій викликає повне руйнування еритроцитів, або β-гемоліз. Їх колонії оточені прозорими зонами різного розміру. Наприклад, Streptococcus pyogenes і Staphylococcus aureus утворюють великі зони гемолізу, a Listeria monocytogenes або Streptococcus agalactiae - Невеликі, дифузні зони. Для визначення гемолітичної активності не слід застосовувати шоколадний агар (ША), тому що утворюються зони α-або β-гемолізу не мають характерних особливостей і викликають однакове позеленіння середовища.
Розміри і форма колоній
Важливі ознаки колоній - їх розміри і форма. Колонії можуть бути великими або дрібними. Величина колоній - ознака, що дозволяє розрізняти різні види, роди і навіть типи бактерій.

У більшості випадків колонії грампозитивних бактерій дрібніше колоній грамнегативних бактерій. Колонії бактерій можуть бути плоскими, піднятими, опуклими, мати втиснутий або піднятий центр. Інша важлива ознака - форма країв колоній. При вивченні форми колоній враховують характер її поверхні: матовий, блискучий, гладкий або шорсткий. Краї колоній можуть бути рівними, хвилястими, часточковими (глибоко порізаними), зубчастими, ерозованих, торочкуватими і т.д. Розміри і форми колоній часто можуть змінюватися. Подібні зміни відомі як дисоціації. Найбільш часто виявляють S - і R - duc социации. S-колонії круглі, гладкі й випуклі, з рівними краями і блискучою поверхнею. R-колонії - неправильної форми, шорсткі, з зубчастими краями.
Колір колоній
При перегляді посівів також звертають увагу на колір колоній. Найчастіше вони безбарвні, білі, блакитні, жовті або бежеві; рідше - червоні, фіолетові, зелені або чорні. Іноді колонії ирризирующими, тобто переливаються всіма кольорами веселки [від грец. Iris, веселка]. Фарбування виникає в результаті здатності бактерій до пігментообразованія. На спеціальних дифференцирующих середовищах, що включають спеціальні інгредієнти або барвники, колонії можуть набувати різноманітну забарвлення (чорну, синю та ін) за рахунок включення барвників або їх відновлення з безбарвної форми. У даному випадку їх забарвлення не пов'язана з утворенням будь-яких пігментів.
Консистенція колоній і особливості росту на середовищі
Корисну інформацію можуть дати консистенція колоній і особливості росту на середовищі. Зазвичай цю інформацію можна отримати при дотику до колоній петлею. Колонії можуть легко зніматися з середи, вростати в неї або викликати її корозію (утворюючи тріщини і нерівності). Консистенція колоній може бути твердою або м'якою. М'які колонії - маслянисті або слівкообразний; можуть бути слизовими (прилипають до петлі) або низькими (тягнуться за петлею).
Тверді колонії - сухі, воскоподібні, волокнисті або крошковатих; можуть бути крихкими і ламатися при дотику петлею.
Запах
Запах - менш важлива ознака колоній, оскільки викликані їм асоціації носять суб'єктивний характер. Зокрема, культури синьогнійної палички мають запах карамелі, культури лістерій - молочної сироватки, протеїв - гнильний запах, нокардії - свіжоскопаного землі.
Біохімічні методи ідентифікації бактерій
Методів, що використовуються для ідентифікації особливостей метаболізму бактерій, дуже багато, але на практиці застосовують невелика їх кількість. Більшість способів засноване на використанні диференційно-діагностичних середовищ, що включають різні індикатори.
Здатність до ферментації вуглеводів
Здатність до ферментації вуглеводів оцінюють по зміні забарвлення середовища внаслідок утворення органічних кислот (відповідно, відбувається зменшення рН), що викликають зміну забарвлення індикатора.
«Строкатий» ряд. Для визначення сахаролитический активності застосовують середовища Хісса; до їх складу входять 1% пептона вода (або МПБ), індикатор Андраде і один з вуглеводів. При розщепленні вуглеводу відбувається зміна кольору середовища з жовтого на червоний. Оскільки бактерії розрізняють за здатністю ферментувати ті чи інші вуглеводи, то ряди пробірок набувають строкатого вигляду. Тому цей набір середовищ і називають «строкатий» (або кольоровий) ряд.
Скляні поплавці. Для визначення здатності мікроорганізмів ферментувати вуглеводи з утворенням кислоти і газу в судини з середовищами вносять скляні поплавці (запаяні з одного кінця короткі трубочки), спливаючі після наповнення їх газом.
Розщеплення білків
Деякі бактерії проявляють протеолітичну активність, виділяючи протеази, що каталізують розщеплення білків. Наявність протеолітичних ферментів з групи колагеназ визначають при посіві уколом в МПЖ. При позитивному результаті спостерігають його розрідження у вигляді лійки або пошарово зверху вниз. Здатність до розщеплення білків і амінокислот також можна оцінювати по зміні забарвлення середовища, тому що утворюються продукти - аміак, індол і сірководень - зрушують рН в лужну сторону, викликаючи зміну забарвлення індикатора.
Освіта аміаку. Для визначення здатності до утворення NH 3 проводять посів у МПБ, і між його поверхнею і пробкою закріплюють смужку лакмусового паперу. При позитивному результаті папірець синіє.
Освіта індолу і H 2 S. Зазвичай для визначення здатності до утворення індолу і сірководню також проводять посів у МПБ, між його поверхнею і пробкою закріплюють папірці: у першому випадку просочені розчином щавлевої кислоти {при утворенні індолу папірець червоніє), у другому - розчином ацетату свинцю (при утворенні H 2 S папірець чорніє). Також використовують спеціальні середовища, що містять індикатори (наприклад, середовище Кліглера), або їх вносять безпосередньо в середу після реєстрації видимого росту бактерій.
Тест на нітратредуктазную активність
Цей тест використовують для ідентифікації окремих видів бактерій. Він дозволяє визначити здатність відновлювати нітрати в нітрити. Здатність до відновлення NO 3 в N0 2, визначають культивуванням в МПБ, що містить 1% розчин KNO 3. Для визначення нітритів у середу додають кілька крапель реактиву Грісса. При позитивному резуль таті спостерігають поява червоного кільця.
Хроматографія
Хроматографічні методи використовують для ідентифікації бактерій і встановлення їх систематичного положення. Об'єкти для дослідження - жирні кислоти клітинної стінки, унікальні інтермедіати і кінцеві метаболіти життєдіяльності бактерій. Хроматографічні системи зазвичай поєднують з комп'ютерами, що значно спрощує облік результатів. Найбільш поширена ідентифікація жирних короткоцепочечних і тейхоєвих кислот методом газорідинної хроматографії. Рідинної хроматографією під високим тиском ідентифікують міколевую кислоту в клітинних стінках мікобактерій. Тонкошарову хроматографію використовують для ідентифікації изопреноидной хінонів клітинної стінки бактерій. У різних родів їх зміст і набір різні, але постійні, що дозволяє встановити систематичне положення кожного конкретного виду.
Індикаторні папірці
Для вивчення біохімічної активності бактерій широко застосовують системи індикаторних папірців чи набори мультімікротестов.
Система індикаторних папірців (СІБ) - набір дисків, просочених різними субстратами. Їх можна безпосередньо вносити в пробірки з суспензією бактерій або заздалегідь помістити в лунки пластикових планшетів, куди будуть внесені досліджувані бактерії. Так, на практиці застосовують набори Minitek Enterobacteriaceaelll і Minitek Neisseria для диференціальної діагностики ентеробактерій (чотирнадцять субстратів) і нейсерій (чотири субстрату), що дозволяють отримати результати через 4 год інкубації при 37 0 С.
Набори мультімікротестов - пластикові планшети, в лунки яких поміщені різні субстрати та індикатори. В лунки вносять різні розведення бактерій і інкубують при 37 ° С. На практиці використовують тести RapID NH для ідентифікації нейсерій та гемофілії, RapID Е для ентеробактерій і ін, що дозволяють отримати результати не пізніше 4-8 ч.
Автоматичні системи ідентифікації бактерій
Автоматичні системи ідентифікації бактерій дозволяють швидко (на 24-48 год швидше звичайних методів) отримати інформацію про вид збудника захворювання і його чутливості до антимікробних препаратів. В даний час найбільшого поширення набули системи типу Microscan і Vitek.
Системи Microscan. Використовують турбідіметричних, колориметрические і флюоресцентні методи ідентифікації бактерій. Системи складаються з комплектів пластикових планшетів, що містять різні субстрати. Грампозитивні та грамнегативні бактерії диференціюють за допомогою флуоресцентних субстратів (час аналізу - 2 год). Для ідентифікації гемофілії, анаеробів і дріжджів використовують хромогенні субстрати, які змінюють своє забарвлення (час аналізу - 4-6 год). Мінімальні інгібуючі концентрації різних антибіотиків визначають по зміні оптичної щільності. Система комп'ютеризована і автоматично проводить всі необхідні розрахунки.
Системи Vitek. У цій системі застосовують один тип планшетів з тридцятьма лункамі.В кожну лунку автоматично вноситься суспензія бактерій з відомою концентрацією мікробних тіл. Ідентифікація мікроорганізмів (гемофілія, нейсерії, дріжджі та анаероби) заснована на турбідометріі реакційного середовища в лунці. У залежності від властивостей мікроорганізму час, необхідний для його ідентифікації, варіює від 4-8 до 18 ч. Система повністю комп'ютеризована і працює автоматично.
Методи ідентифікації нуклеїнових кислот
Методи виявлення РНК і ДНК збудників знайшли застосування в основному при діагностиці вірусних інфекцій. Тим не менш розроблено тест-системи для ідентифікації деяких вибагливих бактерій (наприклад, легіонел, хламідій), а також для ідентифікації колоній Neisseha gonorrhoeae, Haemophilus influenzae типу b, стрептококів групи В, ентерококів і мікобактерій.

Гібридизація нуклеїнових кислот
Найбільш поширені методи гібридизації нуклеїнових кислот (рис. 1-17). Принцип методів зумовлений здатністю ДНК (і РНК) специфічно з'єднуватися (гібридизувати) з комплементарними фрагментами штучно створених ниток ДНК (і РНК), мічених ізотопами або ферментами (пероксидазою або лужною фосфатазою) . Надалі зразки досліджують різними методами (наприклад, ІФА).
Метод гібридизації в розчинах дає найбільш швидкі результати (рис. 1-18, А). Широкому впровадженню методу перешкоджає проблема видалення не зв'язалися ниток нуклеїнових кислот.
Метод гібридизації на твердій основі (рис. 1-18, Б) і його сендвіч-модифікація (рис. 1-18, В) поширений більше. В якості твердої основи служать мембрани з нітроцелюлози або нейлону. Не зв'язавшись реагенти видаляють багаторазовим відмиванням.
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)
Основу методу ПЛР становить каталізуються ДНК-полімеразою багаторазове освіта копій певної ділянки ДНК. Спочатку проводять відпал - термічний поділ двухнитевой молекули ДНК на окремі ланцюжки. Потім середу охолоджують і вносять праймери (затравки), комплементарні нуклеотидним послідовностей обох ланцюжків. Для запуску реакції застосовують синтетичні праймери - олігонуклеотиди, що складаються з 10-20 нуклеоті-дів (наприклад, дезоксінуклеотідтріфосфат), що взаємодіють з закінченнями послідовностей і утворюють послідовності в 50-1000 підстав. Потім у середу вносять термостабільну taq-полімеразу (за назвою бактерії Thermus aquaticus), що запускає утворення вторинних копій ланцюгів ДНК, після чого утворюються двухнитевой молекули ДНК знову підігрівають. Утворюються окремі ланцюжки остуджують, вносять праймери і знову повторюють процедуру підігріву та охолодження; оскільки tag-полімераза термостабільна, то необхідність у її повторному внесенні відсутня (рис. 1-19). ПЛР дозволяє отримати великі кількості досліджуваного фрагмента ДНК навіть у тому випадку, якщо в розпорядженні дослідника є всього лише одна вихідна молекула ДНК геному. Ідентифікацію копій ДНК проводять методом електрофорезу. Метод ПЛР лежить також в основі ДНК-ідентифікації особистості, встановлення спорідненості людей, виявлення генів спадкових хвороб і пр.







Серологічні методи
Класичні серологічні реакції застосовують для виявлення бактеріальних AT, а також для виявлення Аг, особливо для ідентифікації бактеріальних Аг. Серед сучасних методів найбільше поширення знайшли методи твердофазного ІФА і латекс-аглютинації.
Алергологічні методи
Сенсибилизирующей активністю має обмежена кількість бактеріальних Аг. Тому метод шкірних проб застосовують лише при діагностиці туберкульозу, сапу, меліоїдоза, бруцельозу та туляремії.
Біологічні методи
Виділення патогенних бактерій від заражених тварин має велику діагностичну цінність, особливо при контрольному застосуванні імунних сироваток. Мета подібних маніпуляцій - зменшення часу проведення бактеріологічних досліджень.
• При діагностиці інфекцій, викликаних ефектами токсину (наприклад, ботулізму або сибірської виразки), матеріал, імовірно містить збудник і токсин, поміщають у фізіологічний розчин, а потім фільтрують через паперові фільтри, натерті тальком (останній добре адсорбує токсин). Змивами з фільтрів заражають чутливих тварин.
• При діагностиці інфекцій, обумовлених різними патогенними властивостями самого збудника, лабораторних тварин заражають мікробної суспензією.
• Для діагностики бактеріальних інфекцій використовують різних тварин, так як проявляють видову сприйнятливість до різних етіологічним агентам.
Миші чутливі до пневмококів, нейсерії, пастерелл, клостридії, лістерія, возудітелям сибірської виразки, туляремії, чуми, ботулізму, правця, кашлюку і меліоїдоза
Щури чутливі до збудників туберкульозу (бичачого типу), меліоїдоза та ін
Морські свинки чутливі до збудників туберкульозу (людського типу), дифтерії, сапу, чуми, бруцельозу, туляремії, холери, газової гангрени, ботулізму, псевдотуберкульозу і ін
Кролики чутливі до стафілококів, стрептококів, нейсерії, Mycobacterium bovis, збудників газової гангрени, сибірської виразки, ботулізму, правця та ін
Кішки. Тварин заражають стафілококами, збудниками сапу, коклюшу та ін
Мавпи. Їх заражають шигеллами, лістеріями, сальмонелами, збудниками меліоїдоза, коклюшу та ін
Птахи. Кур і голубів використовують для діагностики туберкульозу (пташиного типу), пастерельозу, риносклероми та ін
МЕТОДИ ВИЯВЛЕННЯ ВІРУСІВ
Лабораторні методи при діагностиці вірусних інфекцій включають:
• виділення та ідентифікацію збудника;
• виявлення і визначення титрів противірусних AT;
• виявлення Аг вірусів у зразках досліджуваного матеріалу;
мікроскопічне дослідження препаратів досліджуваного матеріалу.
Забір матеріалу. При заборі матеріалу для досліджень необхідно виконувати наступні умови:
• зразки слід відбирати якомога раніше або з урахуванням ритму циркуляції збудника;
• матеріал слід відбирати в обсязі, достатньому для всього комплексу досліджень;
• зразки слід доставляти в лабораторію негайно (!), При відносно короткочасної транспортування (не більше 5 діб) зразки зберігають на льоду, при більш тривалою - при температурі -50 ° С.
Виділення і культивування вірусів
Виділення та ідентифікація збудника - «золотий стандарт» у діагностиці вірусних інфекцій.
Культури клітин
Віруси розмножуються тільки в живих клітинах, і виділення збудника в зараженій культурі клітин - один з основних методів діагностики вірусних інфекцій. Оскільки більшість патогенних вірусів відрізняє тканинна і типова специфічність, то майже до кожного вірусу можна підібрати відповідні клітинні або тканинні культури, а також створити стандартні умови культивування (наявність клітин одного типу). Розмноження вірусу забезпечують чутливі (перміссівние) клітини. Тому при виділенні невідомого збудника проводять одномоментне зараження 3-4 культур клітин, припускаючи, що одна з них може виявитися перміссівной. Культури клітин отримують диспергированием відповідних органів і тканин, але частіше використовують ембріональні тканини (людини і тварин) або трансформовані пухлинні клітини. При приміщенні на відповідну плоску поверхню клітинні культури зазвичай ростуть у вигляді моношару.
Первинно-тріпсінізірованние культури. Суспензії клітин отримують гомогенізірованіем відповідних тканин, попередньо оброблених трипсином. Культури часто представлені клітинами змішаного типу і не підлягають повторному культивуванню. Життєздатність таких культур становить 2-3 тижні.
Полуперевіваемие лінії клітин представлені диплоїдними клітинами людини і тварин. Культури обмежено придатні до повторного диспергуванню і зростом (як правило, не більше 20-30 пересівань), зберігаючи при цьому життєздатність і не піддаючись спонтанної трансформації.
Перещеплюваних ліній клітин (гетероплоідние культури) представлені клітинами, підданими тривалого культивування та спонтанним трансформаціям. Культури здатні до багаторазового диспергуванню і перевіванію. Робота з ними менш трудомістка в порівнянні з приготуваннями первинних культур; перещеплюваних клітини щодо однакові по своїй морфології і стабільні за властивостями.
Культури органів
Не всі види клітин здатні рости у вигляді моношару, в деяких випадках підтримка диференційованих клітин можливо лише в культурі органу. Зазвичай це суспензія тканини, яка має спеціалізованої функцією, також позначається як культура переживає тканини.
Курячі ембріони
Курячі ембріони (рис. 1-20) - практично ідеальні моделі для культивування деяких вірусів (наприклад, грипу та кору). Замкнута порожнину ембріона перешкоджає проникненню мікроорганізмів ззовні, а також розвитку спонтанних вірусних інфекцій. Ембріони застосовують для первинного виділення вірусів з патологічного матеріалу; для пасирування і збереження їх, а також для отримання необхідних кількостей вірусу. Деякі збудники (наприклад, герпесвіруси) викликають характерні зміни (по них можна розпізнавати захворювання). Зараження проводять на хоріон-аллантоісную оболонку, в амніотичну або аллантоісную порожнину або в жовтковий мішок.
Зараження на хоріон-аллантоісную мембрану. Зазвичай використовують 10-12-добові ембріони. Яйця проглядають в світлі, що проходить, відзначають локалізацію повітряного мішка і вибирають область без судин. Обережно видаляють фрагмент шкаралупи, звільняють зовнішню оболонку і відшаровують її обережним натисканням. Потім роблять отвір у краю повітряного мішка. При отсосе через цей отвір хоріон-аллантоісная оболонка відшаровується від зовнішньої оболонки. На неї наносять досліджуваний матеріал, вільний від бактерій і найпростіших (пропущений через бактеріальні фільтри і оброблений бактерициду).

Зараження в амніотичну порожнину. Зазвичай використовують 7-14-добові ембріони, у яких після відшарування хоріон-аллантоісной оболонки (див. вище) розширюють отвір, захоплюють пінцетом амніотичну оболонку і виводять через хоріон-аллантоісную оболонку. Через неї в амніотичну порожнину вводять досліджуваний матеріал.
Зараження в аллантоісную по щиця. 10-добові ембріони заражають через отвори, зроблені в шкаралупі і підлягають оболонках (див. вище).
Зараження в жовтковий мішок. Використовують 3 ~ 8-добові ембріони, у яких в цьому віці жовтковий мішок займає майже всю порожнину яйця. Зараження проводять через отвір, зроблений в повітряному мішку
Спостереження і облік результатів. В якості віруссодержащего матеріалу можна використовувати вміст жовткового мішка, аллантоісную і амніотичну рідини або весь ембріон, нарізаний разом з оточуючими
тканинами на шматочки. Для виявлення Рис. 1-20.Схематіческое зображення
характерних поразок на хоріон-розвивається курячого ембріона.
аллантоісной мембрані видаляють шкаралупу
і зовнішню оболонку. Потім мембрану виймають і поміщають в стерильну воду. Характер уражень вивчають на темному тлі.
Тварини моделі
При неможливості виділити та ідентифікувати вірус стандартними методами in vitro інфекційний матеріал вводять чутливим до збудника тваринам, і після розвитку типового інфекційного процесу проводять повторне зараження чутливих клітинних культур. Найбільш часто використовують мишей, кроликів і мавп; для виділення деяких вірусів (наприклад, вірусів Коксакі) заражають мишенят-шмаркачів. Внаслідок дорожнечі і складності змісту лабораторних тварин, практично повсюдно їх витіснили клітинні культури. Тим не менш, тварини моделі активно використовують для вивчення особливостей патогенезу і формування імунних реакцій при вірусних інфекціях.
Ідентифікація вірусів
Якісне визначення
Наявність і біологічну активність вірусів визначають по ефектах, які спостерігаються на тваринних моделях (підвищення температури тіла, поява характерних клінічних ознак, загибель і т.д.), курячих ембріонах та на клітинах (в культурах). Під впливом конкретних вірусів можлива зміна морфології, росту, репродукції клітин або їх руйнування. Факт розмноження вірусів у чутливих клітинах in vitro визначають за цитопатическим ефектів (у тому числі бляшкообразованію, тельцям включень), феномену гемадсорбції, «кольорової реакції».
Цитопатична ефекти оцінюють при мікроскопії клітинних культур. За ступенем ураження клітин виділяють віруси з високою або помірної цитопатогенну. Розмноження вірусів у культурах клітин супроводжується порушеннями морфології клітин моношару. Деякі віруси викликають характерні цитопатична зміни, що (з урахуванням клінічної картини захворювання) дозволяє швидко поставити попередній діагноз. Наприклад, розмноження параміксовірусів (віруси кору, паротиту, PC-вірус) супроводжується появою характерних гігантських багатоядерних клітин; аденовіруси викликають утворення скупчень великих круглих клітин, а при репродукції герпесвірусів клітини округлої форми дифузно розташовані по всьому моношар.
Бляшкообразованіе. Бляшки називають негативні колонії - ділянки зруйнованих клітин, що виглядають як зони просвітління на монослоях клітин, покритих шаром агару. У деяких випадках дозу і цитопатогенну вірусу виражають у бляшкообразующіх одиницях (БОЮ).
Тельця включень. Багато віруси викликають появу в заражених клітинах характерних утворень - скупчень вірусних білків або частинок, видимих ​​в світловий мікроскоп. Тельця включень можуть розташовуватися як в цитоплазмі (тільця Гварнері при віспі), так і в ядрах клітин (аденовіруси).
Відсутність цитопатичної ефекту. Деякі віруси (наприклад, вірус краснухи) не проявляють цитопатичної ефекту. Їх можна виявляти з інтерференції іншого вірусу, здатного викликати дегенерацію заражених клітин.
Феномен гемадсорбції. Багато заражені вірусами клітини набувають здатність сорбувати на своїй поверхні різні еритроцити. Феномен гемадсорбції має спільні механізми з гемаглютинації і проявляється на ранніх термінах, до прояву цитопатичної ефекту, при його відсутності або слабкої вираженості.
«Кольорова реакція». У культуральне середовище, використовувану для підтримки клітин, вносять індикатор. Зростання клітин супроводжується накопиченням метаболітів, зрушенням рН середовища і зміною забарвлення індикатора. Зараження вірусом культур різко інгібує клітинний метаболізм, і середовище зберігає первинний колір.
Експрес-діагностика. Для швидкої ідентифікації вірусної інфекції розроблені численні методи експрес-діагностики, засновані на виявленні вірусних Аг. Наприклад, для ранньої діагностики ВІЛ-інфекції широко використовують ІФА, що виявляє поверхневі Ar вірусу.
Кількісне визначення
Кількісне визначення вірусів проводять двома шляхами - вивченням інфекційності і кількісним визначенням вірусних Аг. Визначення титру інфекційності вірусів в значній мірі залежить від методу кількісного дослідження; в бактеріофагів ставлення інфекційність-частка становить приблизно 1 (тобто кожна вірусна частка здатна викликати інфекцію), для вірусів тварин дане відношення становить 1:10 (іноді вище через вірусінгібірующего дії факторів резистентності).
Визначення інфекційності вірусів. Найбільш доступна форма кількісного визначення - підрахунок числа вірусних бляшок. Прямі тести на інфекційність застосовують для встановлення інфекційної дози (ID) або летальної дози (LD) досліджуваного вірусу (звичайно виражають у lg). ID 50 - розведення, що інфікують 50% клітин; LD 50 - розведення, що вбиває 50% уражених клітин або тварин.
Виявлення вірусних Аг і вірусних частинок. Найбільш поширений метод - реакція кількісної гемаглютинації. Метод заснований на здатності вірусів сорбироваться на поверхні еритроцитів тварин і людини. Кількісну електронну мікроскопію застосовують для підрахунку загального числа вірусних (але не інфекційних) часток у досліджуваному об'єкті (наприклад, культуральної рідини).
Морфологія вірусів
Вивчення морфології вірусів можливе лише за допомогою електронної мікроскопії, однак частіше за все цей метод недоступний через відсутність такого дорогого і складного приладу. Більш того, багато збудники морфологічно подібні, що знижує цінність цього методу. Найбільш поширений метод мікроскопії вмісту везикул і тканинних екстрактів, оброблених барвниками (негативний контрастування), з подальшим підрахунком ДНК-або РHK-вірусів. Електронна мікроскопія дозволяє швидко виявити орто-і параміксовіруси у виділеннях дихальних шляхів, герпесвіруси в рідині везикул і ротавіруси у фекаліях.
Серологічні методи ідентифікації
При більшості вірусних інфекцій розвиваються імунні реакції, застосовувані для діагностики. Клітинні реакції зазвичай оцінюють у тестах цитотоксичності лімфоцитів відносно інфекційних агентів або заражених ними клітин-мішеней або визначають здатність лімфоцитів відповідати на різні Аг і мітогени. У роботі практичних лабораторій вираженість клітинних реакцій визначають рідко. Більше поширення знайшли методи ідентифікації противірусних AT.
РН заснована на придушенні цитопатогенної ефекту після змішування вірусу зі специфічними AT. Невідомий вірус змішують з відомими комерційними антисироватки і після відповідної інкубації вносять в моношар клітин. Відсутність загибелі клітин вказує на невідповідність інфекційного агента і відомих AT.
Гальмування гемаглютинації. РГГА застосовують для ідентифікації вірусів, здатних агглютинировать різні еритроцити. Для цього змішують культуральне середовище, що містить збудник, з відомою комерційної антисироватки і вносять у культуру клітин. Після інкубації визначають здатність культури до гемаглютинації і при її відсутності роблять висновок про невідповідність вірусу антисироватки.
Гальмування цитопатичної ефекту інтерференцією вірусів. Реакцію гальмування цитопатичної ефекту за рахунок інтерференції вірусів застосовують для ідентифікації збудника, интерферирующего з відомим Цитопатогенні вірусом в культурі чутливих клітин. Для цього в культуральне середовище, що містить досліджуваний вірус, вносять комерційну сироватку (наприклад, до вірусу краснухи при підозрі на неї), інкубують і заражають другу культуру; через 1-2 дні в неї вносять відомий Цитопатогенні вірус (наприклад, будь ЕСНО-вірус) . При наявності цитопатогенної ефекту роблять висновок про те, що перша культура була заражена вірусом, відповідало застосуванню AT.
Пряма імунофлюоресценція. Серед інших тестів найбільшого поширення знайшла реакція прямої імунофлюоресценції (найбільш швидка, чутлива і відтворна). Наприклад, ідентифікація ЦМВ по цитопатогенної ефекту вимагає не менше 2-3 тижнів, а при використанні мічених моноклональних AT ідентифікація можлива вже через 24 год Маючи набір подібних реагентів, їх можна вносити до культури, заражені вірусом, інкубувати, відмивати не зв'язавшись реагент і дослідити за допомогою люмінесцентної мікроскопії (дозволяє виявити наявність флюоресценції заражених клітин).
Іммуноелектронная мікроскопія (аналог попереднього методу) дозволяє ідентифікувати різні види вірусів, виявлені електронною мікроскопією (наприклад, різні види герпесвірусів), що неможливо зробити, грунтуючись на морфологічних особливостях. Замість антисироваток для ідентифікації використовують помічені різними способами AT, але складність і дорожнеча методу обмежують його застосування.
Виявлення противірусних AT в сироватці
Більш простий і доступний підхід - виявлення противірусних AT в сироватці. Зразки крові необхідно відбирати двічі: негайно після появи клінічних ознак і через 2-3 тижнів. Надзвичайно важливо досліджувати саме два зразки сироватки. Результати одноразового дослідження не можна вважати остаточними через неможливість пов'язати появу AT з цим випадком. Цілком можливо, що ці AT циркулюють після попередньої інфекції. У подібній ситуації роль дослідження сироватки, отриманої в період реконвалесценції, важко переоцінити. На наявність захворювання в період відбору першої проби вказує не менш ніж чотирикратне збільшення титру AT, виявлене при дослідженні другої проби.
Перераховані нижче методи не дозволяють диференціювати AT, що утворюються під час хвороби та циркулюючі після одужання (тривалість цього періоду варіабельна для різних інфекцій). Оскільки для адекватної діагностики необхідно підтвердити достовірне збільшення титрів AT в двох пробах, то першу пробу досліджують в гострій фазі, а другу - в період одужання (через 2-3 тижні). Отримані результати носять ретрос тивні характер і більш придатні для проведення епідеміологічних обстежень.
РГГА виявляє AT, синтезовані проти гемаглютиніну вірусів (наприклад, вірусу грипу). Метод дозволяє легко виявляти подібні AT в сироватці хворого.
РСК - основний метод серодіагностики вірусних інфекцій (серед доступних). Реакція виявляє Комплементзв'язуючі IgM і IgG, але не диференціює їх; для оптимізації одержуваних результатів постановка реакції вимагає певних навичок персоналу.
РІФ. При можливості отримати біоптат інфікованої тканини і доступності комерційних наборів AT, мічених флюоресцеїном, діагноз може підтвердити реакція прямої імунофлюоресценції. Постановка реакції включає інкубацію досліджуваної тканини з AT, їх подальше видалення і люмінесцентну мікроскопію зразка.
Іммуносорбціонние методи (наприклад, ІФА і РІА) більш інформативні, оскільки виявляють IgM і IgG окремо, що дозволяє робити певні висновки про динаміку інфекційного процесу або стані реконвалесценції. Для виявлення AT відомий Аг сорбують на твердому субстраті (наприклад, на стінках пробірок, пластикових мікропланшетах, чашках Петрі) і вносять різні розведення сироватки пацієнта. Після відповідної інкубації не зв'язавшись AT видаляють, вносять антисироватки до lg людини, мічену ферментом, повторюють процедуру інкубування та відмивання незв'язаних AT і вносять будь-якої хромогенний субстрат (чутливий до дії ферменту). Оскільки зміна забарвлення пропорційно вмісту специфічних AT, то цілком можливо визначення їх титру спектрофотометрическим способом. У діагностиці ВІЛ-інфекції найбільше поширення знайшов метод імуноблотингу.
Виявлення вірусних Аг
ІФА. В даний час вже з'явилися комерційні набори для виявлення Аг деяких збудників, що дозволяють їх ідентифікувати протягом 5-10 хв. Для виявлення Аг на твердій фазі сорбують відомі AT і додають сироватку, що містить Аг; після інкубування незв'язаний Аг декантирують, систему промивають і вносять мічені AT, специфічні до сорбованих AT. Повторюють процедуру інкубування та відмивання, вносять хромогенний субстрат, позитивний результат фіксують при зміні забарвлення системи.
Гібридизація ДНК - високоспецифічний метод, що дозволяє ідентифікувати геном вірусу після його гібридизації комплементарними молекулами ДНК. В якості маркера застосовують ферменти та ізотопи. Метод визначає здатність вірусної ДНК гібридизувати з міченої комплементарної ДНК; специфічність методу прямо пропорційна довжині I комплементарної ланцюжка. Перспективний метод гібридизації нуклеїнових кислот in situ. Д ля постановки реакції мічену ДНК наносять на біоптати тканин (у тому числі на фіксовані формаліном або ув'язнені в парафінові блоки) і реєструють взаємодія з комплементарною ДНК. Метод використовують для виявлення вірусів простого герпесу, папіломи людини, Епстайна-Барр та ін
ПЛР. Метод значно збільшує чутливість методу гібридизації, підвищуючи вміст вірусної ДНК в матеріалі, отриманому від хворого, а також прискорює час отримання результату.
МЕТОДИ ДІАГНОСТИКИ ГРИБКОВИХ ІНФЕКЦІЙ
Мікроскопія
Мікроскопія - один з основних методів виявлення збудників мікозів. Дозволяє проводити експрес-діагностику мікозів і отримувати результат протягом 1-2 год, тоді як для виділення культури збудника необхідні тижня. Для експрес-діагностики препарати часто необхідно фарбувати спеціальними барвниками, так як проста фарбування гематоксиліном і еозином часто не дозволяє виявити клітини грибів.
Нефарбовані препарати
Мікроскопія методом висячої або роздавленої краплі. Метод дозволяє виявити структури грибів у клінічних зразках без попереднього фарбування.
Обробка 10% їдким калі (КОН). Метод використовують в першу чергу для візуалізації структур збудників у фрагментах шкіри та її придатках (нігті, волосся), виділеннях осередків ураження і піхви. У зазначених зразках міститься велика кількість клітин, в яких КОН руйнує кератин, залишаючи незміненими клітини грибів.
Пофарбований препарати
Фарбування за Грамом. У мазках з клінічного матеріалу гриби представлені грампозитивними клітинами. Клітини Cryplococcus neoformans погано сприймають барвники, що можна використовувати як диференційно-діагностична ознака при мікроскопії пофарбованих мазків спинномозкову рідину.
Забарвлення нігрозину або тушшю за Буррі мазків СМЖ дозволяє виявити капсульованих клітини Cryptococcus neoformans. Для ідентифікації цього мікроорганізму можна використовувати муцікармін або конго червоний.
Забарвлення за Романовським - Гімзою або Райту мазків крові та кісткового мозку дозволяє виявити дріжджову форму Histoplasma capsulatum в цитоплазмі фагоцитів.
Забарвлення метенаміновим срібним по Гоморі. Метод включає попередню обробку гістологічних препаратів хромової кислотою з наступним нанесенням барвника (клітини грибів темно-сірі або чорні).
Забарвлення за Грідлі. Метод включає попередню обробку препаратів хроматом лейкофуксіна з подальшим нанесенням фуксінового альдегіду і метанілового жовтого (клітини грибів рожево-пурпурні на жовтому тлі).
Фарбування перйодной кислотою і реактивом Шиффа (за Мак-Манус). 1,2-Глікольние угруповання полісахаридів клітинних стінок грибів спочатку окислюються перйодной кислотою до альдегідів, що реагують з сульфитом лейкофуксіна реактиву Шиффа; клітки забарвлюються в насичено рожевий або червоний колір.
Імунофлюоресцентний мікроскопія
Найбільшого поширення знайшла РІФ. Застосовують AT, мічені флюоресцеіна; для виявлення грибкових Аг реагент наносять на гістологічний препарат, інкубують і проводять люмінесцентну мікроскопію.
Виділення грибів.
Культуральні умови і потреби зростання у патогенних грибів відрізняються від таких у збудників бактеріальних інфекцій. Більшість патогенних грибів не вимогливо до живильних середовищах і добре росте в аеробних умовах. Для росту грибів середовища можуть включати будь-якої органічний джерело вуглецю, неорганічних сполук азоту у вигляді нітратів чи амонійних солей. рН поживних середовищ кислий (близько 4,0-6,5), більшість бактерій не здатне рости в подібних умовах. Серед вітамінів більшість грибів потребує водорозчинних (наприклад, біотин, рибофлавіні, тіаміні та ін.) Більшість патогенних видів мезофіли і росте в інтервалі температур 20-45 "С. При виділенні зазвичай роблять парні посіви, один з яких інкубують при 25 0 С, а другий - при 37 ° С; така маніпуляція дозволяє виявити можливий диморфізм. Ідентифікацію збудника проводять за морфологічним і біохімічним ознаками. У практичній роботі зазвичай використовують два типи середовищ - неселективні і селективні.
Неселективні середовища
Найбільш поширений агар Сабуро - пептонний агар з мальтозою (або глюкозою). Його відрізняє високий вміст вуглеводів, інгібуючу розмноження бактерій. Також використовують МПА, картопляно-декстрозний агар, агар Чапека-Докса, дріжджовий агар, сусло-агар та ін Нерідко середовища модифікують додаванням антибіотиків, циклогексимід або хлоргексидину. Для виділення вибагливих патогенів (наприклад, Blastomyces dermatitidis і Histoplasma capsulatum) як збагачених середовищ застосовують 5-10% КА, доповнений сердечним і мозковим екстрактом, або асцитичної агар. Після утворення колоній слід робити пересів на більш прості середовища, наприклад картопляно-декстрозний агар або середовище Сабуро, на яких можна швидше виявити споруляції збудників.
Селективні середовища
Селективні середовища зазвичай отримують на основі неселективних, з додаванням пеніциліну (20 ОД / мл), стрептоміцину (40 ОД / мл) або гентаміцину (0,5 мкг / мл), левоміцетину (16 мкг / мл). Для інгібування бурхливого зростання цвілі, що пригнічують повільно зростаючі диморфні гриби, в середовища вносять циклогексимід (0,5 мкг / мл). Слід пам'ятати, що препарат пригнічує ріст деяких патогенних грибів (наприклад, Cryptococcus neoformans і Aspergillus fumigatus).
Виявлення протигрибкових AT і грибкових Аг
Найбільш часто застосовують реакцію латекс-аглютинації (виявляє IgM), PCK (виявляє IgG) і ІФА. Результати реакцій часто можуть бути сумнівними внаслідок перехресного реагування з Аг різних грибів. Проте ідентифікація AT або циркулюючих Аг в крові, спинномозковій рідині і сечі дозволяє встановити діагноз до отримання результатів посівів.
Шкірні проби раніше були одним з популярних методів діагностики мікозів, проте їх неспецифічність обмежує діагностичну цінність. В даний час їх частіше використовують для вивчення імунного прошарку в популяції при епідеміологічних дослідженнях.
Гібридизація нуклеїнових кислот - новий метод ідентифікації патогенних грибів, розроблений для визначення основних збудників системних мікозів - бласто-, крипто-і кокцидіоїдомікозі, а також гистоплазмоза. Для постановки реакції проводять екстракцію РНК з культури і вносять одноланцюгові молекули ДНК, мічені флюоресцеином. При наявності в культурі одного з чотирьох зазначених збудників відбувається гібридизація відповідної ДНК з РНК патогена з утворенням легко виявлені комплексу. Основна перевага методу - можливість застосування на ранніх термінах (5 діб) в культурах, що містять міцеліальні і дріжджові форми.
МЕТОДИ ВИЯВЛЕННЯ НАЙПРОСТІШІ
Виявлення патогенних найпростіших засноване на ідентифікації морфологічних особливостей збудника і в значній мірі залежить від правильного взяття клінічного матеріалу та адекватної фіксації. Помилки при проведенні цих заходів можуть призвести до отримання помилкових результатів.
Мікроскопія
Пошук патогенних найпростіших зазвичай проводять в субстратах, що є середовищем їх існування - випорожненнях, крові.
Екскременти
Дли адекватного виявленні паразитів у шлунково-кишкового тракту необхідно досліджувати не менше трьох проб, отриманих протягом 10 діб. Для діагностики амебіазу цього може виявитися недостатньо, і при підозрі на це захворювання необхідно дослідити шість проб, отриманих протягом 14 діб. Слід уникати попадання в матеріал води або сечі, що згубно діють на найпростіших. Якщо хворому в діагностичних цілях вводили всередину сульфат барію, мінеральне масло, препарати вісмуту або проводили специфічну терапію, то паркан випорожнень слід проводити не раніше 8-х діб після останнього введення. Для виявлення трофозоітов (рухомих форм) рідкі випорожнення необхідно дослідити протягом 30 хв після отримання; при більш оформленому стільці ці дослідження можна провести протягом години; на більш пізніх термінах трофозоіти зазвичай руйнуються. При неможливості своєчасного обстеження в зразки вносять фіксують розчини, що зберігають морфологію дорослих особин.
Макроскопічне дослідження може виявити домішка крові і слизу (частий діагностична ознака амебіазу). Виявлення ж самих паразитів проводять при світлооптичної мікроскопії вологих нативних препаратів або в забарвлених мазках.
Мікроскопія нативних препаратів. Невелика кількість випорожнень наносять на предметне скло, диспергируют у краплі фізіологічного розчину, накладають покривне скло і досліджують під мікроскопом на наявність трофозоітов (в рідкі випорожнення фізіологічний розчин не вносять). Нативні препарати можна злегка дофарбовувати розчином Люголя, що полегшує виявлення цист. Особливо уважно необхідно досліджувати кров і слиз; бажано готувати окремі препарати, не контаміновані (по можливості) фекальними масами.
Методи накопичення. Для виявлення паразитів, присутніх у незначних кількостях, застосовують різні методи накопичення. При дослідженні калу найбільш часто використовують седиментаційних метод. Для дослідження забирають краплю надосадової рідини, наносять на предметне скло, де змішують з рівним об'ємом фізіологічного розчину, накривають покривним склом і мікроскопіруют. Суміш на предметному склі можна підфарбовувати розчином Люголя, розчин руйнує трофозоіти, але дозволяє добре візуалізувати ядра і включення глікогену в цистах.
Мікроскопії пофарбованих мазків дозволяє не тільки виявляти, але й диференціювати найпростіших; забарвлення найбільш часто проводять гематоксиліном і еозином за Хайденхайну.
Кров
Капілярну чи венозну кров поміщають в пробірку з антикоагулянтом (наприклад, з етилендіамінтетраоцтової кислотою); дослідження необхідно проводити по можливості швидко. Виявлення найпростіших проводять мікроскопією товстих і тонких мазків. Товсті мазки готують з великих об'ємів крові, нанесених на предметне скло; їх зазвичай фарбують за Романовським-Гімзою, чого зазвичай буває цілком достатньо для виявлення паразитів. Тонкі мазки готують для полегшення морфологічної диференціювання паразитів крові, мазки зазвичай забарвлюють за Романовським-Гімзою або Райту.
Зразки різних тканин
Зразки різних тканин відбирають, враховуючи біологію паразита і його типову локалізацію. Зразки шкірних покривів забарвлюють звичайними гістологічними барвниками і мікроскопіруют. Біоптати лімфатичних вузлів, селезінки, печінки, аспірату кісткового мозку і спинномозкової рідини забирають при підозрі на трипаносомоз або лейшманіози. Частина зразків мікроскопують у вигляді нативних мазків, частина забарвлюють за Романовським-Гімзою або Райту. Також можливе фарбування зразків різними гістологічними барвниками, найбільш уживаними для виготовлення препаратів з досліджуваних тканин.
Виділення збудників
Виділення збудників проводять тільки в спеціалізованих лабораторіях, інститутах та центрах; проводити ці заходи в звичайних бактеріологічних лабораторіях неприпустимо. На спеціальних середовищах і культурах тканин можна виділяти і культивувати практично всі патогенні найпростіші.
Серологічні дослідження
Серологічні дослідження - найбільш поширені і доступні діагностичні методи. Їх часто проводять при підозрі на токсоплазмоз, амебіаз (РИГА, латекс-аглютинація), лейшманіози (РИГА), трипаносомоз (РИГА, РСК) і т.д.
Висновок
Детально розглянувши відомі способи ідентифікації різних мікроорганізмів, можна зробити висновок, що в основному це тривалий і трудомісткий процес, що вимагає достатнього набору знань, устаткування і спеціальних умов. Але не співроб на всі труднощі, діагностика є необхідним для ідентифікації мікроорганізмів при встановленні діагнозу інфекційних захворювань чи інших викликаних мікробами процесів і визначення фізіологічних властивостей культури з іншими цілями, наприклад при виборі хіміотерапевтичного препарату. Але шкода, що поки не існує універсального методу для швидкого і якісного визначення мікроорганізму. Кожен метод підходить для певного ряду інфекцій і не годитися для визначення збудників інших захворювань. Також мало поки способів внелабораторной діагностики, тому що, наприклад, часто необхідно наявність чистої культури, що практично неможливо створити в польових умовах. У світі постійно з'являються або виявляються нові невідомі мікроорганізми і, можливо, від швидкості їх ідентифікації буде залежати життя багатьох людей. З усього цього можна зробити висновок, що людству необхідно приділяти більше уваги розвитку мікробіології.

Література:
  1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., «Медична мікробіологія, вірусологія, імунологія», Москва, 1994 р.
  2. Гуріна С.В., Соколова І.П., «Мікробіологія», СПб, 2000 р.
  3. Красильников А.П., Романовська Т.Р., «Мікробіологічний словник-довідник», Мінськ, 1999 р.
  4. Поздєєв О.К. під ред. Покровського В.І., «Медична мікробіологія», Москва, 2002 р.
  5. Прозоркіна Н.В., Рубашкіна Л.А., «Основи мікробіології, вірусології та імунології», Ростов-на-Дону, 2002 р.
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Реферат | 181,2кб. | скачати

Схожі роботи:
Характеристика методів мікробіологічної діагностики стафілококових інфекцій Тести для визначенн
Методи діагностики в психології
Методи радіонуклідної діагностики
Other Лабораторні методи діагностики
Методи променевої діагностики
Методи соціальної діагностики та їх характеристика
Методи діагностики та лікування бешихи
Методи діагностики онкологічних хвороб
Методи діагностики і тренування пам`яті у школярів
© Усі права захищені
написати до нас
Рейтинг@Mail.ru