Реферат на тему:
Методи генної інженерії
2009
Методи генної інженерії
2009
Введення
Сучасний експериментатор нерідко має в своєму розпорядженні лише мізерними кількостями вихідних препаратів індивідуального білка або ДНК. Наприклад, у разі біопсії тканини людини або рідкісного штаму бактерії, погано піддається вирощування в обсязі.
Між тим фізичні методи дослідження вимагають, хоча і на порядок величини меншої кількості біологічного матеріалу, ніж два десятиліття тому, але, все-таки, найчастіше у багато разів більшого, ніж є в наявності. Крім того, багато експерименти мають пошуковий характер, коли необхідно обстежити сотні, якщо не тисячі, паралельних проб, варіюючи умови пошуку.
Все це призвело до розробки методів багаторазового і точного відтворення структури індивідуального білка або фрагмента ДНК, наприклад окремого гена. Заради економії часу ці методи в значній мірі автоматизовані. Більшість з них використовують підходи генної інженерії. Тому ця глава буде присвячена знайомству з поняттями і методами цієї порівняно нової галузі біологічної науки.
Рестріктази
У середині 70-х років було зроблено дивне і не відразу зрозуміле у всій своїй значущості відкриття. З деяких бактерій вдалося виділити ферменти, що мають здатність «розрізати» подвійну спіраль ДНК будь-якого походження, тобто здатністю розривати цукрово-фосфатні ланцюжка в обох нитках. Умовою такого розрізання виявилася наявність у цієї ДНК короткою, але цілком певної послідовності нуклеотидів (рахуючи по одній з ниток у напрямку 5 1 -3 '), так званого «сайту впізнавання» рестріктази. Цей сайт може налічувати від 4-х до 8 нуклеотидів. Помилково думати, що такі короткі послідовності повинні зустрічатися дуже часто. Навіть серія з 4-х, наперед заданих нуклеотидів має реальний шанс з'явитися лише один раз на відрізку ДНК довжиною в 4 4 = 256 пар основ. Для однієї з найбільш часто використовуваних рестриктаз (EcoRl), сайт якої (ГААТТЦ) налічує 6 нуклеотидів, такий шанс з'являється в середньому один раз на ділянці ДНК довжиною в 4 6 = 4096 пар основ. Для деяких рестриктаз (тип I і III) місце розрізу не однозначно пов'язане з положенням сайту впізнавання. Такі рестріктази незручні для дослідницьких цілей. У типу II розріз локалізована в самому сайті впізнавання, що робить цю операцію визначеною.
Два останніх десятиліття пошук нових рестріктаад проводився настільки інтенсивно, що до кінця 1999 року їх було знайдено та очищено більше 2 500. Такий достаток зумовлена великою кількістю видів бактерій, у яких рестріктази служать засобом захисту від вторгнення в них вірусів, чию ДНК вони і руйнують / Для дослідницьких цілей в даний час використовують близько 300 рестриктаз, які є на ринку біохімічних препаратів.
Деякі з рестриктаз розрізають обидві нитки ДНК в одному місці, наче ножем. У інших - місця розрізу можуть бути зрушені на одній нитки ДНК відносно іншої (в межах сайту впізнавання). У першому випадку говорять про «тупих» кінцях розрізу, у другому - про «липких» кінцях обох ниток в області розрізу. Назва «липкі» відображає той факт, що утворюються в цьому випадку на кожній з ниток короткі однониткових послідовності нуклеотидів, очевидно, комплементарні один одному і можуть, взагалі кажучи, знову з'єднатися водневими зв'язками між основами. Хоча це, звісно, не відновить цілісності розрізаного ділянки ДНК. Принаймні до тих пір, поки вже знайомий нам фермент ДНК-лігаза не «зашиє» зроблені рестриктазою розрізи на кожній з ниток.
Могутність новознайденого інструменту для досліджень було цілком оцінено, коли приблизно в ті ж роки було зроблено друге найважливіше відкриття - існування плазмід у бактерій.
Плазміди
Було виявлено, що в багатьох видів бактерій крім основної маси ДНК, що перебуває в «бактеріальної хромосомі» (кілька мільйонів пар основ) є ще «крихітні» кільцеві, двунітевих і суперскрученому молекули ДНК. Вони були названі плазмідами - за місцем розташування їх у протоплазмі клітини. Кількість пар основ у плазмідах обмежена діапазоном від 2-х до 20-ти тисяч. Деякі бактерії мають лише по одній плазміді. В інших - їх можна знайти кілька сотень.
У нормі плазміди редупліціруются при розподілі бактеріальної клітини одночасно з основною ДНК хромосоми. Для свого розмноження вони використовують «хазяйські» ДНК-полімерази I, III і інші ферменти. Плазміди синтезують свої специфічні білки, для чого використовується РНК-полімераза і рибосоми, що теж належать бактерії-хазяїну. У числі цих «продуктів діяльності» плазмід іноді виявляються речовини, що руйнують антибіотики (ампіміцін, тетрациклін, неоміцин та інші). Що додає самої бактерії-хазяїну стійкість проти дії цих антибіотиків, якщо вона сама по собі такої стійкістю не володіє. Мало того. «Самостійність» деяких плазмід тягнеться до того, що вони виявляються здатними розмножуватися в клітині бактерії навіть тоді, коли синтез білка в ній (а отже, і її розподіл) блоковані дією специфічних інгібіторів. У цьому випадку в бактерії може накопичитися до 2-3 тисяч плазмід.
Очищені плазміди здатні проникати з живильного середовища всередину клітин чужорідних бактерій, там обгрунтовуватись і нормально розмножуватися. Правда, для цього доводиться попередньо збільшувати проникність оболонок цих бактерій, обробляючи їх розчином хлористого кальцію.
Успішне вбудовування чужий плазміди вдається лише для незначної меншості клітин оброблюваної популяції. Однак якщо бактерія-реципієнт не володіла стійкістю до певного антибіотика, а «прижилася» плазміда цю стійкість їй повідомляє, то навіть з одиничних успішно «трансформованих» бактерій на живильному середовищі з добавкою антибіотика можна виростити цілком повноцінні колонії, спадково володіють вбудованою плазмидой.
Нарешті, найважливіше. Якщо в ДНК плазміди (до початку трансформації) вдасться «вбудувати» фрагмент зовсім чужою для неї ДНК (наприклад ген тваринного походження), то цей фрагмент разом з плазмидой ввійде всередину клітини реципієнта, разом з нею буде розмножуватися і направляти всередині бактерії синтез «псевдоплазмідних» білків, закодованих в цьому гені!
Згадаймо тепер з якою швидкістю розмножуються бактерії в рідкому поживному середовищі, підтримуючи і примножуючи при цьому синтез плазмідних (а також «псевдоплазмідних»!) Білків. Очевидно, що тут проглядається перспектива напрацювання великої кількості індивідуального білка - продукту діяльності вторгнувшегося («потайки») в бактерію гена. Залишається вирішити проблему вбудовування саме обраного гена в плазмі-ду. А також і одержання первісно необхідної кількості цього самого гена, якщо відправним пунктом є відома (хоча б частково) структура, яка нас цікавить білка. Ось тут-то і розкриються унікальні можливості використання рестриктаз.
Але спочатку кілька слів про виділення самих плазмід з клітин їх нормальних бактерій-господарів. Це - справа не складне. З бактерії можна очистити сумарну ДНК, як це було описано раніше. Потім одним з фізичних методів відокремити низькомолекулярних ДНК плазмід від порівняно високомолекулярної ДНК бактеріальної хромосоми. Треба тільки подбати про те, щоб при розтині клітини не з'явилися малі уламки основний ДНК. Зокрема, не слід користуватися для руйнування оболонок бактерій ультразвуком.
Можна вчинити простіше. Сферопласти бактерій обробити слабкою лугом + DDC-Na або прокип'ятити протягом 1 хвилини. ДНК бактеріальної хромосоми, разом з пов'язаними з нею білками, денатурируется і випадає пластівцями в осад. Її легко видалити центрігурірованіем. ДНК кільцевих плазмід також спочатку денатурируется. Але оскільки її однониткових кільця топологічно пов'язані, вони розійтися не можуть. Після відновлення нормальних умов середовища ренатуріруется і нативна структура плазмід. Вони залишаються в розчині.
За останні роки виділено і очищені сотні плазмід. Їх опис, природно, починається з представлення повної нуклеотидної послідовності плазмідної ДНК. Сучасний-ні автоматичні «секвенатори» дозволяють розшифрувати послідовність 4-х-5-ти тисяч пар нуклеотидів за тиждень. У 80-ті роки, коли секвенування ДНК робили вручну, така робота займала кілька місяців.
Докладні дані про кожною новою плазміді, включаючи і карту розташування її власних генів, заносять до міжнародної «бібліотеку плазмід».
Вбудовування фрагмента чужорідної ДНК в плазміду
За допомогою бібліотеки плазмід можна без зусиль відшукати таку плазміду, в ДНК якої є (випадково) сайт впізнавання для однієї з доступних рестриктаз. Для рестриктаз теж є своя бібліотека і, як вже згадувалося, близько 300 їх видів є в продажу. Таким чином у дослідника є широкі можливості вибору найбільш зручною комбінації плазміди і рестріктази.
Далі розрізають обраної рестриктазою зручну плазміду так, щоб утворилося два «липких» кінця. Потім потрібно забезпечити такими ж кінцями фрагменти вбудовуваної ДНК. Добре, якщо по обох кінцях цього фрагмента розташуються сайти впізнавання обраної рестріктази. Але це випадок малоймовірний. Надходять наступним чином. До власних закінченнях наявного фрагмента ДНК нарощують двунітевих ділянки штучних (синтезованих хімічно) олігонуклеотидів. Завідомо містять сайти впізнавання обраної рестріктази. Потім дією цієї самої рестріктази їх перетворюють на «липкі» кінці - у точності відповідні липким кінців плазміди по обидві сторони зробленого в ній розрізу. (Розповісти про те як нарощують кінці фрагмента ДНК було б, мабуть, занадто складно для нашого курсу. Зате я трохи пізніше постараюся пояснити яким чином синтезуються штучні олігонук-леотіди з наперед заданою послідовністю пар основ.)
Отже, далі в буферному розчині змішують дві ДНК, - плазміди і вставки, - і витримують їх при оптимальній температурі «гібридизації». Чужорідна ДНК «вбудовується» в ДНК плазміди, хоча і може перевищувати її по довжині, тобто досягати розміру в кілька тисяч пар основ. Остаточне злиття, «приживання» нової ДНК, зрозуміло, забезпечують ДНК-лігази.
Я вжив термін «гібридизація». Що він означає в даному випадку? Домовимося називати так освіту двухнитевой структури внаслідок контакту двох комплементарних однониткових послідовностей нуклеотидів, типу ДНК-ДНК або ДНК-РНК. Термін «комплементарні» нам вже знайомий. Послідовності можуть бути однакової довжини, тоді утвориться суцільно двухнитевой «гібрид». А можуть бути і значно різної довжини. У цьому випадку утворюється «ділянку гібридизації», відповідний довжині коротшого з двох партнерів. Мінімальна довжина ділянки гібридизації, при якій він досить стійкий, - це 8-10 пар нуклеотидів. Втім, для сталої гібридизації комплементарних липких кінців двох молекул ДНК цю цифру можна зменшити вдвічі, так як двунітевих структури самих ДНК будуть підтримувати новостворений коротка ділянка гібридизації.
Може виникнути питання: а чому сама розрізана плазми-Демида не відновлює кільцеву структуру шляхом гібридизації своїх власних липких-решт? Ну, по-перше для порівняно короткою ДНК плазміди не так-то просто, розпрямившись, мимовільно знову згорнутися в кільце. По-друге, що вбудовується фрагмент ДНК береться у великому надлишку з тим, щоб процес вбудовування в плазміду мав конкурентну перевагу по відношенню до процесу відновлення плазміди. З цією ж метою 5'-фосфатні групи з місця розрізу плазміди прибирають дією ще одного ферменту - «лужної фосфату-зи». Спочатку досить, щоб з'єдналася одна пара липких кінців, що належать плазміді і вбудовуваної ДНК. З часом, неодмінно, завдяки тепловим рухам прилучиться й друга пара.
І все-таки поставлене питання не марний. Повністю уникнути «реставрації» порожніх плазмід, дійсно, не вдається. На щастя знайдено спосіб розрізняти серед колоній бактерій, що виросли на середовищі з антибіотиком, ті, які дали притулок «порожню« плазміду від тих, що отримали плазміди з вбудованим фрагментом чужий ДНК. Спосіб цей дуже гарний. Ідея його така. Деяка модифікація самої плазміди дозволяє їй у «співпраці» з основним геномом бактерії E.coli у присутності якогось хромогенного субстрату (схожого на лактозу) синтезувати продукт блакитного кольору. У результаті на чашці з агаром виростають блакитні колонії бактерій. Вставку ж чужорідного фрагмента ДНК виробляють б такому місці, що плазміда втрачає здатність до «співпраці». У результаті чого виростають колонії білого кольору. Їх-то і відбирають, щоб вже у великому обсязі рідкого живильного середовища нарощувати бактеріальну масу з плазмідами і чужорідної ДНК. Таким чином вирішується завдання множення кількості («клонування») цікавить нас ДНК.
Зауважу принагідно, що описаним вище способом у плазміду можна вставити так званий «поліклоновий сайт». Це - синтезована хімічно послідовність у кілька десятків пар нуклеотидів, підібрана таким чином, що в ній містяться сайти впізнавання доброї дюжини різних рестрік-таз. Це істотно розширює можливості експерименту.
Деякі прийоми експериментальної мікробіології
Мені тільки що довелося використовувати терміни: «чашка з агаром», «колонії бактерій». Оскільки спеціалізація в галузі молекулярної біології вимагає розуміння методів і доброго володіння прийомами мікробіології, варто пояснити про що йде мова.
Коли для лабораторних потреб нарощують значну кількість бактерій, це роблять у великих колбах, наповнених рідким живильним середовищем. Такі середовища готують і продають у сухому вигляді спеціалізуються на цьому фірми. Для збереження доступу повітря колби закривають ватними тампонами (обгорнутими в марлю) і стерилізують в автоклаві. Після «інокуляції» - внесення до них малої порції бактерій колби витримують в «теплій кімнаті», де підтримується температура 37 ° С, протягом ночі. При цьому їх встановлюють на механічній гойдалці заради поліпшення аерації. За ніч середовище стає мутною - таке в ній наростає кількість бактерій. Їх неважко зібрати центрифугуванням. У мікробіологічної промисловості у величезних сталевих ферментерах з примусовою аерацією нарощують тонни (1) бактерій. Потім з них виділяють речовини, що використовуються в якості харчових добавок до корму худоби або у фармакології.
Якщо ж стоїть завдання відібрати в лабораторії бактерії, що відрізняються певними властивостями (наприклад, стійкістю до дії антибіотиків) надходять прямо протилежним чином. Стежать за наростанням потомства одиничних бактерій. Для цього використовують особливу речовину - агар. Його виділяють з певного виду морських водоростей. Вже змішаний з живильним середовищем «бакто-агар» поставляється у висушеному вигляді. Його розчиняють в гарячій воді, стерилізують в автоклаві і розливають в стерильні «чашки Петрі». Це - круглі, плоскодонні пластмасові чашки діаметром у 9 і висотою в 1 сантиметр з кришками. Бактоагар застигає у вигляді дуже пористої твердої маси, пори якої заповнені поживним бульйоном.
Досліджувану популяцію бактерій багаторазово розбавляють з таким розрахунком, щоб у 2-3-х мілілітрах суспензії, які виливають на поверхню агару, містилося лише близько сотні бактерій. Вони випадковим чином розподіляються по поверхні агару. Далі закриті чашки на 12-14 годин залишають в теплій кімнаті. (Перевернувши, для того щоб поживний бульйон притікає до поверхні агару.) Кожна бактерія дає численне потомство, яке добре видно оком. Це і є «колонії» бактерій. Початкове розведення і час інкубації вибирають так, щоб колонії не зливалися один з одним.
Залишається додати, що при всіх описаних операціях виконуються вимоги суворої стерильності. Інокуляцію колб з живильним середовищем, розлив бакто-агару в чашки, розбавлення суспензій бактерій і нанесення пробних аліквотах на агар виробляються в спеціальному, так званому «ламінарному» заскленому шафі. Через який безперервно, у напрямку з шафи в кімнату прокачується стерилізований проходженням через фільтр повітря.
Сучасний експериментатор нерідко має в своєму розпорядженні лише мізерними кількостями вихідних препаратів індивідуального білка або ДНК. Наприклад, у разі біопсії тканини людини або рідкісного штаму бактерії, погано піддається вирощування в обсязі.
Між тим фізичні методи дослідження вимагають, хоча і на порядок величини меншої кількості біологічного матеріалу, ніж два десятиліття тому, але, все-таки, найчастіше у багато разів більшого, ніж є в наявності. Крім того, багато експерименти мають пошуковий характер, коли необхідно обстежити сотні, якщо не тисячі, паралельних проб, варіюючи умови пошуку.
Все це призвело до розробки методів багаторазового і точного відтворення структури індивідуального білка або фрагмента ДНК, наприклад окремого гена. Заради економії часу ці методи в значній мірі автоматизовані. Більшість з них використовують підходи генної інженерії. Тому ця глава буде присвячена знайомству з поняттями і методами цієї порівняно нової галузі біологічної науки.
Рестріктази
У середині 70-х років було зроблено дивне і не відразу зрозуміле у всій своїй значущості відкриття. З деяких бактерій вдалося виділити ферменти, що мають здатність «розрізати» подвійну спіраль ДНК будь-якого походження, тобто здатністю розривати цукрово-фосфатні ланцюжка в обох нитках. Умовою такого розрізання виявилася наявність у цієї ДНК короткою, але цілком певної послідовності нуклеотидів (рахуючи по одній з ниток у напрямку 5 1 -3 '), так званого «сайту впізнавання» рестріктази. Цей сайт може налічувати від 4-х до 8 нуклеотидів. Помилково думати, що такі короткі послідовності повинні зустрічатися дуже часто. Навіть серія з 4-х, наперед заданих нуклеотидів має реальний шанс з'явитися лише один раз на відрізку ДНК довжиною в 4 4 = 256 пар основ. Для однієї з найбільш часто використовуваних рестриктаз (EcoRl), сайт якої (ГААТТЦ) налічує 6 нуклеотидів, такий шанс з'являється в середньому один раз на ділянці ДНК довжиною в 4 6 = 4096 пар основ. Для деяких рестриктаз (тип I і III) місце розрізу не однозначно пов'язане з положенням сайту впізнавання. Такі рестріктази незручні для дослідницьких цілей. У типу II розріз локалізована в самому сайті впізнавання, що робить цю операцію визначеною.
Два останніх десятиліття пошук нових рестріктаад проводився настільки інтенсивно, що до кінця 1999 року їх було знайдено та очищено більше 2 500. Такий достаток зумовлена великою кількістю видів бактерій, у яких рестріктази служать засобом захисту від вторгнення в них вірусів, чию ДНК вони і руйнують / Для дослідницьких цілей в даний час використовують близько 300 рестриктаз, які є на ринку біохімічних препаратів.
Деякі з рестриктаз розрізають обидві нитки ДНК в одному місці, наче ножем. У інших - місця розрізу можуть бути зрушені на одній нитки ДНК відносно іншої (в межах сайту впізнавання). У першому випадку говорять про «тупих» кінцях розрізу, у другому - про «липких» кінцях обох ниток в області розрізу. Назва «липкі» відображає той факт, що утворюються в цьому випадку на кожній з ниток короткі однониткових послідовності нуклеотидів, очевидно, комплементарні один одному і можуть, взагалі кажучи, знову з'єднатися водневими зв'язками між основами. Хоча це, звісно, не відновить цілісності розрізаного ділянки ДНК. Принаймні до тих пір, поки вже знайомий нам фермент ДНК-лігаза не «зашиє» зроблені рестриктазою розрізи на кожній з ниток.
Могутність новознайденого інструменту для досліджень було цілком оцінено, коли приблизно в ті ж роки було зроблено друге найважливіше відкриття - існування плазмід у бактерій.
Плазміди
Було виявлено, що в багатьох видів бактерій крім основної маси ДНК, що перебуває в «бактеріальної хромосомі» (кілька мільйонів пар основ) є ще «крихітні» кільцеві, двунітевих і суперскрученому молекули ДНК. Вони були названі плазмідами - за місцем розташування їх у протоплазмі клітини. Кількість пар основ у плазмідах обмежена діапазоном від 2-х до 20-ти тисяч. Деякі бактерії мають лише по одній плазміді. В інших - їх можна знайти кілька сотень.
У нормі плазміди редупліціруются при розподілі бактеріальної клітини одночасно з основною ДНК хромосоми. Для свого розмноження вони використовують «хазяйські» ДНК-полімерази I, III і інші ферменти. Плазміди синтезують свої специфічні білки, для чого використовується РНК-полімераза і рибосоми, що теж належать бактерії-хазяїну. У числі цих «продуктів діяльності» плазмід іноді виявляються речовини, що руйнують антибіотики (ампіміцін, тетрациклін, неоміцин та інші). Що додає самої бактерії-хазяїну стійкість проти дії цих антибіотиків, якщо вона сама по собі такої стійкістю не володіє. Мало того. «Самостійність» деяких плазмід тягнеться до того, що вони виявляються здатними розмножуватися в клітині бактерії навіть тоді, коли синтез білка в ній (а отже, і її розподіл) блоковані дією специфічних інгібіторів. У цьому випадку в бактерії може накопичитися до 2-3 тисяч плазмід.
Очищені плазміди здатні проникати з живильного середовища всередину клітин чужорідних бактерій, там обгрунтовуватись і нормально розмножуватися. Правда, для цього доводиться попередньо збільшувати проникність оболонок цих бактерій, обробляючи їх розчином хлористого кальцію.
Успішне вбудовування чужий плазміди вдається лише для незначної меншості клітин оброблюваної популяції. Однак якщо бактерія-реципієнт не володіла стійкістю до певного антибіотика, а «прижилася» плазміда цю стійкість їй повідомляє, то навіть з одиничних успішно «трансформованих» бактерій на живильному середовищі з добавкою антибіотика можна виростити цілком повноцінні колонії, спадково володіють вбудованою плазмидой.
Нарешті, найважливіше. Якщо в ДНК плазміди (до початку трансформації) вдасться «вбудувати» фрагмент зовсім чужою для неї ДНК (наприклад ген тваринного походження), то цей фрагмент разом з плазмидой ввійде всередину клітини реципієнта, разом з нею буде розмножуватися і направляти всередині бактерії синтез «псевдоплазмідних» білків, закодованих в цьому гені!
Згадаймо тепер з якою швидкістю розмножуються бактерії в рідкому поживному середовищі, підтримуючи і примножуючи при цьому синтез плазмідних (а також «псевдоплазмідних»!) Білків. Очевидно, що тут проглядається перспектива напрацювання великої кількості індивідуального білка - продукту діяльності вторгнувшегося («потайки») в бактерію гена. Залишається вирішити проблему вбудовування саме обраного гена в плазмі-ду. А також і одержання первісно необхідної кількості цього самого гена, якщо відправним пунктом є відома (хоча б частково) структура, яка нас цікавить білка. Ось тут-то і розкриються унікальні можливості використання рестриктаз.
Але спочатку кілька слів про виділення самих плазмід з клітин їх нормальних бактерій-господарів. Це - справа не складне. З бактерії можна очистити сумарну ДНК, як це було описано раніше. Потім одним з фізичних методів відокремити низькомолекулярних ДНК плазмід від порівняно високомолекулярної ДНК бактеріальної хромосоми. Треба тільки подбати про те, щоб при розтині клітини не з'явилися малі уламки основний ДНК. Зокрема, не слід користуватися для руйнування оболонок бактерій ультразвуком.
Можна вчинити простіше. Сферопласти бактерій обробити слабкою лугом + DDC-Na або прокип'ятити протягом 1 хвилини. ДНК бактеріальної хромосоми, разом з пов'язаними з нею білками, денатурируется і випадає пластівцями в осад. Її легко видалити центрігурірованіем. ДНК кільцевих плазмід також спочатку денатурируется. Але оскільки її однониткових кільця топологічно пов'язані, вони розійтися не можуть. Після відновлення нормальних умов середовища ренатуріруется і нативна структура плазмід. Вони залишаються в розчині.
За останні роки виділено і очищені сотні плазмід. Їх опис, природно, починається з представлення повної нуклеотидної послідовності плазмідної ДНК. Сучасний-ні автоматичні «секвенатори» дозволяють розшифрувати послідовність 4-х-5-ти тисяч пар нуклеотидів за тиждень. У 80-ті роки, коли секвенування ДНК робили вручну, така робота займала кілька місяців.
Докладні дані про кожною новою плазміді, включаючи і карту розташування її власних генів, заносять до міжнародної «бібліотеку плазмід».
Вбудовування фрагмента чужорідної ДНК в плазміду
За допомогою бібліотеки плазмід можна без зусиль відшукати таку плазміду, в ДНК якої є (випадково) сайт впізнавання для однієї з доступних рестриктаз. Для рестриктаз теж є своя бібліотека і, як вже згадувалося, близько 300 їх видів є в продажу. Таким чином у дослідника є широкі можливості вибору найбільш зручною комбінації плазміди і рестріктази.
Далі розрізають обраної рестриктазою зручну плазміду так, щоб утворилося два «липких» кінця. Потім потрібно забезпечити такими ж кінцями фрагменти вбудовуваної ДНК. Добре, якщо по обох кінцях цього фрагмента розташуються сайти впізнавання обраної рестріктази. Але це випадок малоймовірний. Надходять наступним чином. До власних закінченнях наявного фрагмента ДНК нарощують двунітевих ділянки штучних (синтезованих хімічно) олігонуклеотидів. Завідомо містять сайти впізнавання обраної рестріктази. Потім дією цієї самої рестріктази їх перетворюють на «липкі» кінці - у точності відповідні липким кінців плазміди по обидві сторони зробленого в ній розрізу. (Розповісти про те як нарощують кінці фрагмента ДНК було б, мабуть, занадто складно для нашого курсу. Зате я трохи пізніше постараюся пояснити яким чином синтезуються штучні олігонук-леотіди з наперед заданою послідовністю пар основ.)
Отже, далі в буферному розчині змішують дві ДНК, - плазміди і вставки, - і витримують їх при оптимальній температурі «гібридизації». Чужорідна ДНК «вбудовується» в ДНК плазміди, хоча і може перевищувати її по довжині, тобто досягати розміру в кілька тисяч пар основ. Остаточне злиття, «приживання» нової ДНК, зрозуміло, забезпечують ДНК-лігази.
Я вжив термін «гібридизація». Що він означає в даному випадку? Домовимося називати так освіту двухнитевой структури внаслідок контакту двох комплементарних однониткових послідовностей нуклеотидів, типу ДНК-ДНК або ДНК-РНК. Термін «комплементарні» нам вже знайомий. Послідовності можуть бути однакової довжини, тоді утвориться суцільно двухнитевой «гібрид». А можуть бути і значно різної довжини. У цьому випадку утворюється «ділянку гібридизації», відповідний довжині коротшого з двох партнерів. Мінімальна довжина ділянки гібридизації, при якій він досить стійкий, - це 8-10 пар нуклеотидів. Втім, для сталої гібридизації комплементарних липких кінців двох молекул ДНК цю цифру можна зменшити вдвічі, так як двунітевих структури самих ДНК будуть підтримувати новостворений коротка ділянка гібридизації.
Може виникнути питання: а чому сама розрізана плазми-Демида не відновлює кільцеву структуру шляхом гібридизації своїх власних липких-решт? Ну, по-перше для порівняно короткою ДНК плазміди не так-то просто, розпрямившись, мимовільно знову згорнутися в кільце. По-друге, що вбудовується фрагмент ДНК береться у великому надлишку з тим, щоб процес вбудовування в плазміду мав конкурентну перевагу по відношенню до процесу відновлення плазміди. З цією ж метою 5'-фосфатні групи з місця розрізу плазміди прибирають дією ще одного ферменту - «лужної фосфату-зи». Спочатку досить, щоб з'єдналася одна пара липких кінців, що належать плазміді і вбудовуваної ДНК. З часом, неодмінно, завдяки тепловим рухам прилучиться й друга пара.
І все-таки поставлене питання не марний. Повністю уникнути «реставрації» порожніх плазмід, дійсно, не вдається. На щастя знайдено спосіб розрізняти серед колоній бактерій, що виросли на середовищі з антибіотиком, ті, які дали притулок «порожню« плазміду від тих, що отримали плазміди з вбудованим фрагментом чужий ДНК. Спосіб цей дуже гарний. Ідея його така. Деяка модифікація самої плазміди дозволяє їй у «співпраці» з основним геномом бактерії E.coli у присутності якогось хромогенного субстрату (схожого на лактозу) синтезувати продукт блакитного кольору. У результаті на чашці з агаром виростають блакитні колонії бактерій. Вставку ж чужорідного фрагмента ДНК виробляють б такому місці, що плазміда втрачає здатність до «співпраці». У результаті чого виростають колонії білого кольору. Їх-то і відбирають, щоб вже у великому обсязі рідкого живильного середовища нарощувати бактеріальну масу з плазмідами і чужорідної ДНК. Таким чином вирішується завдання множення кількості («клонування») цікавить нас ДНК.
Зауважу принагідно, що описаним вище способом у плазміду можна вставити так званий «поліклоновий сайт». Це - синтезована хімічно послідовність у кілька десятків пар нуклеотидів, підібрана таким чином, що в ній містяться сайти впізнавання доброї дюжини різних рестрік-таз. Це істотно розширює можливості експерименту.
Деякі прийоми експериментальної мікробіології
Мені тільки що довелося використовувати терміни: «чашка з агаром», «колонії бактерій». Оскільки спеціалізація в галузі молекулярної біології вимагає розуміння методів і доброго володіння прийомами мікробіології, варто пояснити про що йде мова.
Коли для лабораторних потреб нарощують значну кількість бактерій, це роблять у великих колбах, наповнених рідким живильним середовищем. Такі середовища готують і продають у сухому вигляді спеціалізуються на цьому фірми. Для збереження доступу повітря колби закривають ватними тампонами (обгорнутими в марлю) і стерилізують в автоклаві. Після «інокуляції» - внесення до них малої порції бактерій колби витримують в «теплій кімнаті», де підтримується температура 37 ° С, протягом ночі. При цьому їх встановлюють на механічній гойдалці заради поліпшення аерації. За ніч середовище стає мутною - таке в ній наростає кількість бактерій. Їх неважко зібрати центрифугуванням. У мікробіологічної промисловості у величезних сталевих ферментерах з примусовою аерацією нарощують тонни (1) бактерій. Потім з них виділяють речовини, що використовуються в якості харчових добавок до корму худоби або у фармакології.
Якщо ж стоїть завдання відібрати в лабораторії бактерії, що відрізняються певними властивостями (наприклад, стійкістю до дії антибіотиків) надходять прямо протилежним чином. Стежать за наростанням потомства одиничних бактерій. Для цього використовують особливу речовину - агар. Його виділяють з певного виду морських водоростей. Вже змішаний з живильним середовищем «бакто-агар» поставляється у висушеному вигляді. Його розчиняють в гарячій воді, стерилізують в автоклаві і розливають в стерильні «чашки Петрі». Це - круглі, плоскодонні пластмасові чашки діаметром у 9 і висотою в 1 сантиметр з кришками. Бактоагар застигає у вигляді дуже пористої твердої маси, пори якої заповнені поживним бульйоном.
Досліджувану популяцію бактерій багаторазово розбавляють з таким розрахунком, щоб у 2-3-х мілілітрах суспензії, які виливають на поверхню агару, містилося лише близько сотні бактерій. Вони випадковим чином розподіляються по поверхні агару. Далі закриті чашки на 12-14 годин залишають в теплій кімнаті. (Перевернувши, для того щоб поживний бульйон притікає до поверхні агару.) Кожна бактерія дає численне потомство, яке добре видно оком. Це і є «колонії» бактерій. Початкове розведення і час інкубації вибирають так, щоб колонії не зливалися один з одним.
Залишається додати, що при всіх описаних операціях виконуються вимоги суворої стерильності. Інокуляцію колб з живильним середовищем, розлив бакто-агару в чашки, розбавлення суспензій бактерій і нанесення пробних аліквотах на агар виробляються в спеціальному, так званому «ламінарному» заскленому шафі. Через який безперервно, у напрямку з шафи в кімнату прокачується стерилізований проходженням через фільтр повітря.
Література
1 Довгяло О.П., Федоренко Н.М. Ішемічна хвороба серця. - М.: Медицина, -1986.
2 Долгов В.В. Морфо-функціональна характеристика ендотелію судинної стінки в нормі і при атеросклерозі. Автореф. Док. дис. - М. -1985.
3 Долгушин І.І., Зурочка А.В., Чукічев А.В., Колесніков А.Л. Роль нейтрофілів у регуляції імунної реактивності і репаративних реакцій пошкодження тканини. / / Вісник Росс. Акад. мед.наук.-2000. N 2. -C.-14-19.
1 Довгяло О.П., Федоренко Н.М. Ішемічна хвороба серця. - М.: Медицина, -1986.
2 Долгов В.В. Морфо-функціональна характеристика ендотелію судинної стінки в нормі і при атеросклерозі. Автореф. Док. дис. - М. -1985.
3 Долгушин І.І., Зурочка А.В., Чукічев А.В., Колесніков А.Л. Роль нейтрофілів у регуляції імунної реактивності і репаративних реакцій пошкодження тканини. / / Вісник Росс. Акад. мед.наук.-2000. N 2. -C.-14-19.