Мембранні білки

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.


Нажми чтобы узнать.
скачати

Мембранні білки: характеристика та структурні принципи

1. Структура мембранних білків

Основна роль ліпідів у складі мембран полягає в стабілізації біслойную структури, а білки є активними компонентами біомембран. Ми обговоримо деякі принципи, які опинилися корисними для з'ясування структурних особливостей мембранних білків. Ми наведемо приклади, що ілюструють ці принципи.

На зорі розвитку мембранології вважали, що мембранні білки по своїй структурі досить гомогенні і укладені у вигляді 3-шарів по поверхні бішару. Зараз скоріше схильні вважати, що принаймні у трансмембранних білків ті їх ділянки, які занурені в мембрану, містять а-спіралі. Звичайно, дуже хотілося б зробити якісь однозначні висновки з цього приводу, але вони повинні грунтуватися на фактичних даних. Перед лицем величезного структурного розмаїття розчинних білків приходиш до висновку, що інтегральні мембранні білки можуть виявитися набагато складніше, ніж ми зараз представляємо. Класифікація розчинних білків за типами структур була проведена тільки після того, як встановили з високою роздільною здатністю структуру більш 100 різних білків. Що стосується трансмембранних білків, то це вдалося зробити тільки в одному випадку - для білка фотосинтетичного реакційного центру бактерій. Разом з електронно-мікроскопічними даними низького дозволу про структуру бактериородопсина це єдине джерело, на якому може грунтуватися побудова моделей для більшості інших трансмембранних білків.

Ще один важливий момент - способи прикріплення білків до мембрани. Вони схематично представлені на рис. 3.1.

-часть Н + -АТРазы, которая связывает ся с Fo -частью, погруженной в мембрану; можно упомянуть также некоторые белки цитоскелета. 1. Зв'язування з білками, зануреними у бішар. В якості прикладів можна навести Fi-частина Н +-АТРази, яка пов'язує ся з Fo-частиною, зануреної в мембрану; можна згадати також деякі білки цитоскелету.

2. Зв'язування з поверхнею бішару. Ця взаємодія має в першу чергу електростатичну природу або гідрофобну. На поверхні деяких мембранних білків є гідрофобні домени, які утворюються завдяки особливостям вторинної або третинної структури. Зазначені поверхневі взаємодії можуть використовуватися як доповнення до інших взаємодій, наприклад до трансмембранному заякоріванію.

  1. Зв'язування з допомогою гідрофобної «якоря»; ця структура зазвичай виявляється як послідовність неполярних амінокислотних залишків. Деякі мембранні білки використовують як якір кова-лентно пов'язані з ними жирні кислоти або фосфоліпіди.

  2. Трансмембранні білки. Одні з них перетинають мембрану тільки один раз, інші - кілька разів.

Відмінностями між зовнішніми і внутрішніми мембранними білками не задається однозначно спосіб їх прикріплення до бішар; ці відмінності визначають лише відносну силу їх зв'язування.

2. Очищення мембранних білків

Для очищення інтегральних мембранних білків і отримання їх в біохімічно активній формі необхідні детергенти, що дозволяють солюбілізіровать білки і зберегти їх в розчині. Відповідні вимоги до детергентів і правилам поводження з ними створюють додаткові проблеми крім тих, з якими зазвичай стикаються при очищенні білків. Для виділення інтегральних мембранних білків розроблено багато спеціальних методів, проте більшість схем очищення заснована на тих же хроматографічних та гідродинамічних методиках, які використовуються для розчинних білків. Це хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі, сефароза або гідроксилу-патіте, гель-фільтрація, центрифугування в градієнті щільності сахарози і т. д. Дуже важливий правильний вибір детергенту, оскільки саме детергент руйнує біомембрані, займаючи місце ліпідів, що оточують той чи інший білок, і визначає стабільність білка в розчині. Механізми дії детергентів розглянуті в огляді.

2.1. Детергент

Протягом останніх двох десятиліть з'явилося дуже багато детергентів, придатних для очищення інтегральних мембранних білків. У принципі потрібно намагатися знайти такий детергент, який не порушував би вторинну і третинну структури мембранних білків, а лише заміщав б більшість або всі мембранні ліпіди, що контактують з гідрофобними ділянками білкової молекули. Кінцевою метою солюбілізаціі є вбудовування білка в детергенти міцел; подальша стратегія очищення полягає в поділі таких білково-детергентних комплексів.

Перша проблема - це підбір оптимальних умов солюбілі-зації досліджуваного білка. Детергенти, денатуруючих білки, не підходять для вирішення такого делікатного доручення. З іншого боку, багато детергенти недостатньо ефективно руйнують мембрани і утворюють белоксодержащіе змішані міцели. Такі детергенти можуть бути або занадто гідрофобними, або занадто гідрофільними для ефективного змішування з мембранними ліпідами і - при досить високій їх концентрації - для перетворення бішару в глобулярні змішані міцели. Спочатку сподівалися, що вибір необхідного детергенту вдасться систематизувати за допомогою одного параметра, званого гідро-ною-ліпофільним балансом. Цей параметр, що змінюється від 1 до 20, використовується при одержанні сурфактантів в якості запобіжного відносної гідрофобності. Дійсно, отримані якісь кореляції, з яких випливає, що значення ГЛБ детергенту може використовуватися для передбачення його поведінки в біологічних системах. Взагалі кажучи, можна сказати, що детергенти зі значенням ГЛБ в діапазоні від 12,5 до 14,5 є ​​найбільш ефективними розчинниками інтегральних мембранних білків. Однак згодом з'ясувалося, що пошук оптимальних детергентів для певного мембранного білка вимагає врахування багатьох факторів, і завжди повинен супроводжуватися емпіричної перевіркою. Необхідно враховувати наступне.

  1. Максимальна солюбілізація досліджуваного білка. Критерієм є перехід білка в супернатанті після центрифугування, при якому відбувається осадження мембрани.

  2. Солюбілізація білка в потрібній формі. Звичайно мова йде про збереження його ферментативної активності, але іноді використовуються певні спектральні характеристики або наявність конкретних білкових асоціатів. Крім того, необхідною умовою є стабільність білка після солюбілізаціі. У деяких випадках для підтримки біохімічної активності разом з детергентом додають екзогенні фосфоліпіди. Як приклад можна привести отримання лактозопермеази Є. coli і білка натрієвого каналу. Іноді для стабілізації білка після солюбілізаціі додають гліцерин або інший поліоли. Має сенс використовувати також інгібітори протеаз і проводити солюбилизацию в умовах, що зводять до мінімуму ймовірність їх протеолитического розщеплення.

  3. Можливість використання детергенту в даній методиці. Необхідно перш за все враховувати заряд детергенту, поведінка при даному значенні рН, ККМ і розмір міцел детергенту. Останні властивості особливо важливі. Детергенти з низькою ККМ, що утворюють великі міцели, не видаляються при діалізі або ультрафільтрації з-за дуже низької концентрації мономерів детергенту. З практичної точки зору це означає, що якщо концентрувати білок за допомогою ультрафільтрації, то буде зростати і концентрація детергенту з низькою ККМ, а це може призвести до денатурації білка. З цієї причини багато дослідників вважають за краще використовувати детергенти з високими ККМ, наприклад октілглюкозід, солі жовчних кислот або більш сучасні цвіттеріонние детергенти. -2. Дуже цінними є полістіреновие смоли, такі, як біобідз SM -2. Вони вибірково зв'язуються з детергентами типу тритон Х-100, видаляють їх з розчину і дозволяють обійтися взагалі без діалізу. Ще один фактор, який необхідно враховувати, - це поглинання світла детергентом. Деякі детергенти, наприклад тритон Х-100, поглинають в ближній УФ-області, що робить неможливим визначення концентрації білка з вимірювання оптичної щільності при довжині хвилі 280 нм.

З урахуванням усіх цих факторів стає зрозуміло, чому в багатьох випадках при виділенні інтегральних мембранних білків доводиться використовувати різні детергенти. Наприклад, для солюбілізаціі можна застосовувати тритон Х-100, а поділ за допомогою ДЕАЕ-целюлози краще проводити в присутності октілглюкозіда. Детергенти можна міняти на стадії хроматографії, під час центрифугування в градієнті щільності, а в деяких випадках - за допомогою діалізу. Слід мати на увазі, що детергент, непридатний для солюбілізаціі певного білка, може бути дуже ефективним для збереження білка в розчині після заміни детергенту. Очищення майже завжди слід проводити при надлишку детергенту в розчині, в іншому випадку рівновага буде зрушено убік агрегації мембранних білків, а не в бік утворення білково-детергентних комплексів. У деяких випадках подібна агрегація може бути навіть бажана, і остання стадія очищення може складатися у видаленні детергенту. Але, як правило, при нестачі детергенту відбуваються необоротне осадження і втрата білка.

Необхідність підтримки концентрації детергенту на певному рівні створює додаткові труднощі крім тих, з якими зазвичай стикаються при очищенні білків; про деякі з них ми вже говорили. Проблеми виникають і при використанні стандартного методу висолювання при високій концентрації сульфату амонію: у багатьох випадках білок осідає в комплексі з детергентом і ліпідом. Оскільки сольовий розчин має високу щільність, а детергент в агрегаті - відносно низьку, то при центрифугуванні преципітат буде залишатися на поверхні. Важливо пам'ятати, що очищенню піддаються білково-детергентних комплекси, нерідко зі значною кількістю пов'язаного фосфолипида. Це позначається на якості поділу при хроматографування, а також на результатах характеристики кінцевого прорастворімих білків, потрібно визначити число і молекулярну масу поліпептидних субодиниць, їх стехіометрію, розмір і, можливо, форму молекули, а також, якщо це необхідно, біохімічну активність.

Детергент 1

У табл. 1 і 2 перераховані найбільш широко використовувані детергенти і вказані їх властивості, важливі для обговорюваних нами питань. Емпірично найбільш ефективними є: 1) неіонні детергенти (тритон Х-100, октілглюкозід), 2) солі жовчних кислот (холато, дезоксихолатом), 3) цвіттеріонние детергенти (CHAPS, цвнттергент). Але вибір детергенту, найбільш прийнятного для солюбілізаціі і очищення певного мембранного ферменту, як і раніше здійснюється методом проб і помилок.

ККМ, мМ

Мовляв. Маса

1 Розмір А мнцелли

. Грегаціоніс число

х Питома обсяг, мл / г

Посилання

Долецілсульфат

1,33

288

24 500

85

0,864


натрію







Холато натрію "

3

408

2100

5

0,778

(612, 1383]

Дезоксихолатом

0,91

392

23 000

55

0,771


натрію "








0,11

538

68 000

12

0,973


Трітоі Х-100 2)

0,24

628

90 000

140

0,908


Твін 80 2)

0,012

1300

76 000

60

0,8%


Лаурілдіметіл-

2,2

229

17 000

75

1,112

| 612]

аміноксид







-Октил- ^-D-Октіл-

25

293

8000

27

0,820

[1242, 1213

глюкозид






612]

-Лаурил- ^-D-Лаура-

0,16

510

50 000

98

0,820


мальтозід







CHAPS

8

615

6150

10

0,802


Цвіттергеіт

3,6

335

-

-

0,957


3. ХАРАКТЕРИСТИКА ОЧИЩЕНИХ ІНТЕГРАЛЬНИХ МЕМБРАННИХ БІЛКІВ

Характеристика очищених мембранних білків, навіть найпростіших, може становити певні труднощі. Як і у випадку

3.1 МОЛЕКУЛЯРНА МАСА субодиниць

Електрофорез у поліакриламідному гелі в присутності додеціл-сульфату натрію - це звичайна методика, але у випадку інтегральних мембранних білків при її застосуванні виникають особливі проблеми. У цьому методі додецилсульфат зв'язується з поліпептидними ланцюгами, і комплекси білок-ДНС поділяються в поліакриламідному гелі відповідно до їх стоксовим радіусами, які в більшості випадків залежать від молекулярної маси. Молекулярну масу визначають, порівнюючи електрофоретична рухливість даного комплексу та відомого стандарту. Проте пов'язання ДСН з невідомим білком може якісно відрізнятися від зв'язування зі стандартами, і тоді буде отриманий неправильний результат. Подібна ситуація спостерігається для інтегральних мембранних білків з високим вмістом неполярних амінокислотних залишків. З більшістю розчинних білків ДСН утворює комплекси в співвідношенні 1,4 г ДСН на 1 г білка, а з білками, що містять великий відсоток неполярних залишків, може зв'язуватися більше детергенту. Виникає при цьому додатковий негативний заряд призводить до аномального підвищення електрофоретичної рухливості, і визначається молекулярна маса виявляється менше, ніж насправді. Можлива й інша ситуація. Зв'язується з ДСН мембранний білок може перебувати в не повністю розгорнутому стані, що теж приведе до аномального підвищення електрофоретичної рухливості через утворення більш компактного комплексу білок-ДСС. Всі ці ефекти вельми істотні. Наприклад, лактозопермеаза має уявну мовляв. масу 33 ТОВ, якщо вимірювати її за допомогою електрофорезу в ПААГ у присутності ДСН; насправді ж, як показують результати генетичного аналізу, її мовляв. маса дорівнює 46 ТОВ. У багатьох випадках вдається оцінити молекулярну масу більш точно, якщо побудувати графік Фергюсона, що представляє собою залежність електрофоретичної рухливості від вмісту акриламіду як для стандартних білків, так і для досліджуваного білка. Цей графік залежить від радіуса Стокса і в меншій мірі - від заряду комплексу. Наприклад, за результатами електрофорезу в 12%-ном акріламідном гелі одна з субодиниць цитохромної-р про комплексу Є. coli має уявну мовляв. масу 28 ТОВ, а з графіка Фергюсона виходить величина 43 ТОВ, що співпадає з мовляв. масою, розрахованої за даними про секвенування відповідної ДНК.

Ще одна проблема - можлива наявність четвертинної структури. Деякі мембранні білки агрегує навіть у присутності ДСН. Наприклад, глікофорину А або білок оболонки бактеріофага М13 при електрофорезі в поліакриламідних гелях з ДСН знаходяться в основному у вигляді димерів. Іноді агрегація ще більше посилюється при нагріванні суміші білок-ДСС. Така картина спостерігається, наприклад, для субодиниць як мітохондрії-альної, так і бактеріальної термінальних оксидаз. Щоб оцінити здатність білка до незворотної агрегації, слід провести порівняльний аналіз результатів електрофорезу в поліакрилу-мідном гелі з ДСН для прогрітих і непрогрітий проб. Подібна проблема іноді виникає через присутність детергенту, використаного при очищенні мембранного білка. Цей детергент необхідно видалити і замінити на ДСН, оскільки в деяких випадках спостерігається чітка залежність електрофоретичної рухливості від присутності детергенту, за допомогою якого солюбілізнровалі фермент.

Отже, є підстави думати, що оцінка молекулярної маси субодиниць сильно неполярних інтегральних мембранних білків, визначена за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН, може виявитися невірною. До нещастя, проста альтернатива цьому методу відсутній, і правильну величину часто отримують або за даними про повну первинної послідовності, або за допомогою точного гідродинамічного аналізу.

3.2 ВИЗНАЧЕННЯ МОЛЕКУЛЯРНОЇ МАСИ нативного білка за допомогою гідродинамічного методу

Застосування цих методів для мембранних білків може бути пов'язане з великими труднощами, викликаними зв'язуванням детергенту. Щоб оцінити це повною мірою, розглянемо спочатку простий розчинний білок, для якого встановлена ​​мовляв. маса субодиниць за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН і необхідно дізнатися, чим він є в неденатурований, активній формі - мономером, димером або олігомером більш високого порядку. Для визначення молекулярної маси білків часто використовується гель-фільтрація, що включає порівняння зі стандартними білками; тут виникають проблеми, пов'язані з тим, що всі стандартні білки мають глобулярну форму, а досліджуваний білок може бути не глобулярним, а злегка подовженим. Такий білок з мовляв. масою 50 000 може елюіровать зі швидкістю, що відповідає мовляв. травні

се 100 ТОВ. У зв'язку з цим колонка для гель-фільтрації повинна бути прокалибровать у відповідності зі значеннями радіусу Стокса, тобто з розмірами «еквівалентної гідродинамічної сфери», а крім того, паралельно необхідно використати який-небудь інший метод. Зазвичай вимірюють швидкість седиментації з допомогою або аналітичного ультрацентрнфугірованія, або центрифугування в градієнті щільності сахарози. Коефіцієнт седиментації дорівнює

де м - молекулярна маса білка,

— вязкость раствора, б — плотность раствора. v - його парціальний питомий об'єм, ij - в'язкість розчину, б - щільність розчину.

Оскільки е і Ч відомі, a Rc можна визначити за допомогою гель-фільтрації, залишаються тільки дві невідомі величини - v і м. Для водорозчинних білків v можна обчислити виходячи з амінокислотного складу або безпосередньо виміряти або просто прийняти рівним 0,72-0,75 мл / г. 0 , можно найти м. Таким чином, вимірявши S 0, можна знайти м.

Розглянемо тепер ситуацію з мембранним білком. Тут виникають додаткові проблеми, оскільки гідродинамічна частка - це білково-детергентних комплекс, тому м і v в даному випадку є молекулярною масою і питомим об'ємом комплексу, М до і К,. На жаль, К, не можна оцінити, не знаючи нічого про склад комплексу. У цьому випадку для знаходження молекулярної маси білка використовують два методи.

  1. Прямо вимірюють кількість зв'язаного детергенту на 1 г білка. Для цього використовують спектральні методи або радіоактивно мічений детергент, а для виділення комплексів застосовують різні методи, наприклад гель-фільтрацію. Встановивши відносний вміст білка і детергенту в комплексі, значення К, отримують як середньозважене відповідних величин для чистого білка і чистого детергенту. Після цього без праці знаходять м оскільки співвідношення між білком і детергентом в комплексі відомо, знаходять молекулярну масу білка.

  2. 0 в средах с разными значениями плотности раствора д. Такие среды обычно получают, используя смеси НгО и D 2 O . Из графика зависимости S ° от q Вимірюють S 0 в середовищах з різними значеннями густини розчину д. Такі середовища зазвичай отримують, використовуючи суміші НГО і D 2 O. З графіка залежності S ° від q . При этом предполагается, что К, — это средневзвешенное соответствующих величин для чистого белка и чистого детергента. знаходять як Л / "так і v t. При цьому передбачається, що К, - це середньозважене відповідних величин для чистого білка і чистого детергенту.

    Оціни Квеле * і взявши детергент з таблиць, отримують молекулярну масу білкової складової м,.

    Для побудови графіка залежності 5 ° від q проводять аналітичне центрифугування. 2 O , но анализ результатов в этом случае гораздо сложнее, хотя принципиально не отличается от предыдущего случая. Можна проводити центрифугування і в градієнті щільності сахарози, використовуючи суміші Н2О і D 2 O, але аналіз результатів у цьому випадку набагато складніше, хоча принципово не відрізняється від попереднього випадку.

    Альтернативний спосіб визначення молекулярної маси нативної форми мембранного білка полягає в рівноважному ультрацентрифугирование. Розподіл речовини в стані рівноваги таке, що нахил графіка залежності логарифма концентрації від г 2 дорівнює

    де р - відстань від центру ротора до даної точки в центріфужний пробірці, W - Частота обертання.

    Якщо величина У відома або її легко оцінити, як для більшості розчинних білків, це завдання вирішується досить просто. Що стосується мембранних білків, то в цьому випадку визначають на-

    Таблиця 3. Зв'язування детергентів з деякими мембранними білками

    Білок

    Na + / К *-АТРази

    Детергент Тритон Х-100

    Кількість пов'язаного детергенту, мг на 1 мг білка

    0,28

    Посилання

    Са 2 +-АТРази

    Тритон Х-100

    0,20


    Білок смуги 3

    Тритон Х-100

    0,77


    Ацетилхолінових

    Тритон Х-100

    0,70


    рецептор




    Родопсин

    Тритон Х-100

    1,10


    Переносник

    Трітоі Х-100

    1,5


    ADP / ATP




    Інсулііовий

    Тритон Х-100

    0,15; 0,31; 0,54


    рецептор




    Інсулііовий

    Дезоксихолатом

    0,01; 0,03


    рецептор




    Цитохром

    Тритон Х-100

    0,6


    с-оксидаза




    Цитохром

    Лаурілмальтозід

    0,55


    , получаемых смешиванием НгО и D 2 O . Как и ранее, одновременно находят М к и К, и далее определяют молекулярную массу белка. клон зазначеної прямий при різних значеннях q, одержуваних змішуванням НГО і D 2 O. Як і раніше, одночасно знаходять М к і К, і далі визначають молекулярну масу білка.

    Якщо в комплексі присутній третій компонент, виникають додаткові проблеми. У будь-якому випадку всі описані процедури досить складні і можуть давати помилкові результати. Кількість детергенту, пов'язаного з очищеними інтегральними мембранними білками, може бути досить істотним - від 0,3 до 1,5 від маси білка, і навіть невеликі помилки в цій величині приведуть до значного спотворення молекулярної маси білка. У табл. 3.3 наведені дані про кількість детергентів, присутніх у деяких білкових препаратах. Зауважимо, що розчинні білки з цими детергентами не зв'язуються; це знову свідчить про те, що за зв'язування з детергентом відповідальна саме неполярная частина білка, зазвичай контактує з мембранними ліпідами.

    3.3 МЕТОД РАДІАЦІЙНОЇ Інактивація

    Метод радіаційної інактивації для визначення розміру мішені все частіше застосовується при дослідженні мембранних білків. Вивчати можна як очищені білки, так і неочищені препарати, в тому числі інтактні біомембрани. Суть методу полягає у визначенні частки білкових молекул, які отримують пошкодження при опроміненні. Для цього використовують ферментативні методи зв'язування гормонів або інших лігандів або спектральні методи. Процедура полягає в наступному. Зразок, зазвичай заморожений, піддають високоенергетичному опроміненню. Через різні проміжки часу відбирають проби, розморожують їх і проводять вимірювання. Пошкодження білка під дією випромінювання виявляють, наприклад, за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН. Як показує досвід, деякі субодиниці повністю втрачають біологічну активність при внесенні радіаційного пошкодження в будь-яке місце поліпептидного ланцюга. Ключовим моментом є те, що, чим більше білкова молекула, тим більше вірогідність її пошкодження і, отже, ймовірність інактивації. Ця ймовірність залежить не від форми молекули, а від її маси. Зазвичай для того, щоб полегшити інтерпретацію результатів, паралельно опромінюють білок з відомою молекулярною масою. Якщо досліджуваний білок містить більше однієї субодиниці, виникають певні труднощі при аналізі результатів. Пошкодження однієї субодиниці не обов'язково супроводжується розривом ковалентних зв'язків в інших субодиниць. Тому для ферментів, що складаються з різних субодиниць, що володіють неоднаковими активностями, можуть бути отримані різні розміри мішені в залежності від методу визначення ступеня інактивації.

    Примітною особливістю методу є те, що його можна використовувати для вивчення інтегральних мембранних білків in . situ. Виникаючі при цьому артефакти і проблеми розглянуті в роботі. Одна з очевидних проблем - необхідність використання високоенергетичного випромінювання. У зв'язку з цим більшість робіт доводиться проводити в співпраці з лабораторіями, в яких є відповідні джерела і освоєні спеціальні методи аналізу.

    3.4 спектральними методами та ВТОРИННА СТРУКТУРА

    Для визначення вмісту а-спіралей і / 3-шарів в мембранних білках використовують кілька методів. У відсутність тривимірної організації на їх основі можна спробувати побудувати відповідні моделі. Найчастіше використовується метод кругового дихроїзму. Все більш широке застосування знаходять інфрачервона та раманівська спектроскопія, а також ЯМР.

    1. Метод кругового дихроїзму заснований на вимірюванні різниці поглинання ліво-і правополярізованного світла; ця оптична активність є мірою хіральності молекул, або мірою їх асиметрії. У далекій ультрафіолетової області КД визначається в основному поглинанням амідів карбонільних груп поліпептидного кістяка. За наявності ділянок вторинної структури, наприклад а-спіралей, спектр КД має цілком певні особливості, пов'язані з особливостями електронного оточення аміди груп у цих структурах. Аналізізуя спектр КД білків, його зазвичай представляють як суму компоіеітов, що відповідають поглинанню різних ділянок білкової молекули: а-спіралей, / 3-шарів і випадкових клубків. Визначивши тим чи іншим способом спектри кожної з цих структур, проводять їх підсумовування, підбираючи відповідні коефіцієнти таким чином, щоб було досягнуто найкраще відповідність виміряного спектру. Підібрані вагові коефіцієнти являють собою ту частку, яка припадає в молекулі на кожен з типів вторинної структури.

    Ці методи були розроблені для розчинних білків, але немає ніяких підстав сумніватися, що їх можна з успіхом застосовувати і для мембранних білків. Швидше за все у останніх є ділянки з такими ж типами вторинної структури, як і у розчинних білків, і при їх вивченні виникнуть такі ж труднощі. Деякі білки можна вивчати in , используя суспензии мембран. situ, використовуючи суспензії мембран. Прикладами такого роду є бактеріородопсин з пурпурної мембрани Halobacterium halobium і Са 2 +-АТРази з мембрани саркоплазматі-чеського ретикулуму. Очищені мембранні білки можна досліджувати за допомогою КД та в присутності детергентів, якщо поглинання останніх у дальній УФ-області не надто велика, або у складі реконструйованих везикул. Тут виникають дві проблеми: 1) диференціальне світлорозсіювання, коли розмір мембранних часток набагато більше довжини хвилі світла, 2) вирівнювання поглинання через концентрування білка в мембранах або везикулах, тобто через негомогенності його розподілу в розчині. Ці артефакти можуть бути досить істотними, однак їх можна врахувати з допомогою відповідних методів.

    На жаль, для внутрішніх мембранних білків відсутні структурні дані високої роздільної здатності, тому точна інтерпретація спектрів КД неможлива. За винятком декількох випадків, різні спектральні методи не використовувалися для вивчення одного і того ж білка і кількісне порівняння результатів не проводилося. Цікаво, що для бактериородопсина, який досліджували методами КД, ІЧ та ЯМР, у всіх трьох випадках були отримані однакові результати, що свідчать про значне вмісті в цьому білку 3-шарів. Тим не менше у кожного методу є істотні недоліки. Так, дані про високий вміст в бактеріородопсин Д-шарів в значній мірі залежать від способу обліку оптичних артефактів. Судячи за даними електронно-мікроскопічної реконструкції, харатерізующімся відносно низьким дозволом, в бактеріородопсин 80% припадає на частку а-спіра-лей, а 0-шари відсутні зовсім. Щоб зрозуміти причину цих невідповідностей, необхідно провести структурний аналіз білка з атомною роздільною здатністю. Є ще два білки, які пронизують мембрану, з високим змістом, і а-токсин Staphylococcus . aureus. Обидва цих білка беруть участь в утворенні пір в бішарі.

    2. Інфрачервона спектроскопія і спектроскопія комбінаційного розсіяння. Ці методи не тільки дозволяють отримати відомості про конформації мембранних ліпідів, а й можуть використовуватися для дослідження вторинної структури білків. Коливальний спектр поліпептидного кістяка залежить від типу вторинної структури і дає інформацію про вміст у молекулі а-і / 3-структур. Цими методами можна досліджувати висушені на повітрі плівки, водні суспензії мембран, а також очищені білки як у присутності детергенту, так і в складі реконструйованих везикул. Наприклад, за даними ІЧ-спектроскопії з перетворенням Фур'є комплекс Са 2 +-АТРази в мембрані складається в основному з а-спіральних ділянок та ділянок, що мають кон-формацію статистичного клубка, а гідрофобний білок мієлін у реконструйованих везикулах має як а-, так і / 3-ділянки.

    3. ЯМР-спектроскопія також може використовуватися для вивчення мембранних білків. Проте можливості методу в цьому випадку обмежені, що пов'язано головним чином з відносно повільними рухами інтегральних мембранних білків in и в комплексах с детергентом. situ і в комплексах з миючим засобом. Тому такий потужний метод, як двовимірний ЯМР, який може дати детальну картину конформаційно-ного стану порівняно невеликих білків у розчині, поки непридатний для вивчення мембранних білків. Більш прийнятний метод ЯМР твердих зразків. Великими можливостями мають методи 2 Н-і | 3 С-ЯМР, хоча до цих пір вони застосовувалися не дуже широко. Отримані дані про усередненої конформації кістяка й динаміці бічних ланцюгів. Слід зазначити, що методи ЯМР твердого стану не тільки не використовуються широко, але в більшості випадків їх і не можна використовувати. Проте в тих рідкісних ситуаціях, коли їх застосування виявляється можливим, вони є дуже цінними.

    3.5 Ферментативна активність

    Одним з найбільш важливих методів характеристики очищених мембранних білків безсумнівно є визначення біохімічної активності. При цьому використовуються в основному такі ж критерії, як і для розчинних білків, але можуть виникати і свої труднощі. Перша з них пов'язана з тим, що біохімічна активність мембранних білків часто дуже сильно залежить від зв'язування з білком ліпідів і детергентів. Втрата активності може бути як оборотної, так і незворотною. Доцільно мати якусь оцінку питомої активності досліджуваного білка in или в составе мембран до солюбилизации. vivo або у складі мембран до солюбілізаціі. Надлишок детергенту може надавати інгібуючий ефект, наприклад за рахунок розбавлення неполярних субстратів в популяції міцел і зменшення ферментативної активності. Вимірюючи активність будь-якого мембранного білка, необхідно мати на увазі, що in он находится в окружении липидов, обеспечивающих оптимальную активность. situ він знаходиться в оточенні ліпідів, що забезпечують оптимальну активність. Друга проблема пов'язана з білками, що володіють «трансбіслойной» активністю; прикладами можуть служити білки, що утворюють канали, і транспортні білки. У цих випадках необхідно враховувати переміщення розчинених речовин з одного компартмента в іншій.

    3.6 Четвертинний СТРУКТУРА І хімічного зшивання

    Багато мембранні ферменти є комплекси, що складаються з декількох субодиниць. Як приклад можна навести Н +-АТРази, Na + / К +-АТРази, мітохондріальні комплекси електронного транспорту і фотосинтетичні реакційні центри. Деякі інтегральні мембранні білки міцно пов'язані з розчинними білками за допомогою нековалентних взаємодій. У Є. coli -компонент, содержащий по данным электрофореза в ПААГ-ДСН три типа субъединиц, образует протонный канал, a Fo-компонент, який містить за даними електрофорезу в ПААГ-ДСН три типи субодиниць, утворює протонний канал, a , состоящий из пяти типов субъединиц, содержит активный центр, участвующий в гидролизе АТР. Fi, що складається з п'яти типів субодиниць, містить активний центр, який бере участь у гідролізі АТР. Для таких білків дуже важливо визначити характер субодиниць, стехіометрію комплексу і найближчі взаємодії його компонентів. Це дуже непросте завдання навіть тоді, коли білковий комплекс вже ізольований. Виникаючі тут проблеми по суті не відрізняються від таких для розчинних білкових комплексів, але є і свої додаткові складності.

    Перш за все слід мати на увазі, що взаємодія між суб'еднніцамі дуже сильно залежить від типу ліпідів і детергентів, з якими пов'язані білки. Наприклад, сукцінатде-гидрогеназой Є. coli при солюбілізаціі її за допомогою луброла РХ представляється складається з чотирьох субодиниць, а при солюбілізаціі більшістю інших детергентів, у тому числі тритоном Х-100, - тільки з двох. Відомо, що оперон sdh кодує всі чотири поліпептиду, а форма з двох субодиниць має аномальний спектр ЕПР. Таким чином, ясно, що in фермент состоит из четырех субъединиц. vivo фермент складається з чотирьох субодиниць. Однак сукцінатдегідрогеназной активністю володіють обидві форми, тому використовувані біохімічні критерії важливі для висновку, чи була солюбілізірована правильна форма.

    Ще одна проблема пов'язана з тим, що в бішарі мембранні білки можуть утворювати комплекси з-за високої їх локальної концентрації. При солюбілізаціі ж незалежно від використовуваного детергенту може відбутися розведення мембранних білків і їх роз'єднання. За законом діючих мас це призведе до дисоціації комплексів, в яких взаємодія між компонентами не дуже сильне. Часто буває важко визначити, який комплекс утворюється in , а какой — прн солюбилизации и очистке. situ, а який - прн солюбілізаціі та очищення. $ . Подібні проблеми виникають при дослідженні багатьох складних систем, наприклад системи / 3-адренергетіческій рецептор-адеіілатці-Клазен, ланцюги електронного транспорту У мітохондрій, системи мік-Росомних цитохромів Р450 і b $.

    -концевых аминокислот; 3) определение отношения массы субъединиц в ДСН-полиакриламидных гелях путем определения интенсивности окрашивания, с помощью радиоавтографии или иммуноблоттинга. Для вивчення стехіометрії субодиниць та їх асоціації в очищеному комплексі використовується всього кілька методів: 1) хімічна дещо зшивання; 2) кількісний аналіз N-кінцевих амінокислот; 3) визначення ставлення маси субодиниць в ПДН-поліакриламідних гелях шляхом визначення інтенсивності фарбування, за допомогою радіоавтографіі або иммуноблоттинга. Кожен метод має свої обмеження, але всі вони використовувалися на практиці. -коицевых аминокислот, а трех субъедиииц Fo -компоиента Н + -АТРазы Е. coli Наприклад, стехіометрію п'яти субодиниць нікотинового ацетил-холііового рецептора визначали за допомогою кількісного аналізу N-коіцевих амінокислот, а трьох суб'едіііц Fo-компоіента Н +-АТРази Є. coli - За допомогою поділу в ПДН-поліакриламідних гелях. Зауважимо, що Кумассі діамантовий синій, що часто використовується для фарбування білків після розділення в ПААГ-ДСС, зв'язується переважно з білками, що містять основні амінокислотні залишки, і існують приклади сильно неполярних внутрішніх мембранних білків, які лише ледь забарвлюються.

    Хімічне зшивання застосовувалося для визначення ближніх взаємодій як в очищених білкових комплексах, так і в комплексах in . situ. Для аналізу ближніх взаємодій в мембранних білках використовується кілька специфічних гідрофобних зшиваючих агентів. Деякі з них представлені в табл. 3.4. Вживані методи не відрізняються від таких для розчинних систем. Продукти зшивання зазвичай аналізують з допомогою електрофорезу в ПААГ, часто з використанням розщеплюваних зшиваючих агентів, що дозволяє аналізувати поліпептиди. Застосовують також антитіла до індивідуальних поліпептиду для иммуноблоттинга після електрофорезу в ПААГ-ДСС, щоб ідентифікувати компоненти кожного з утворених продуктів. Можна було б припустити, що при відносно великому часу життя реагентів білки в біомембранах будуть зшивати в результаті простої дифузії в бішарі. Однак, за даними декількох робіт, це не так: продукти зшивання представляють собою специфічні білкові асоціати, а не випадкові освіти. Так, в фотосинтетичної мембрані Rhodobacter capsulata утворюються зшивки лише між субодиницями компонентів реакційного центру, а також між реакційним центром і «антенним» комплексом В870, які беруть участь у передачі енергії реакційного центру.

    І нарешті, відзначимо, що хімічна зшивання часто використовувалося для ідентифікації інтегральних мембранних білків, які зв'язуються з відомими розчинними компонентами. -субъединиц Fo - kom - понента Н + -АТРазы с /3-субъединицей растворимого компонента Fi ; 2) цитохрома с с субъединицами митохондриальной цитохром с-оксидазы; 3) пептидных гормонов с рецепторами гормонов. Як приклад можна навести зшивання 1) а-і b-субодиниць Fo - kom - компонентів Н +-АТРази с / 3-субодиницею розчинної компонента Fi; 2) цитохрому с з субодиницями мітохондріальної цитохром с-оксидази, 3) пептидних гормонів з рецепторами гормонів.

    Таблиця 4. Деякі зшиваючі реагенти, що використовувалися для визначення четвертинної структури мембранних білків "

    Додати в блог або на сайт

    Цей текст може містити помилки.

    Біологія | Реферат
    130.1кб. | скачати


    Схожі роботи:
    Мембранні потенціали
    Мембранні розділові модулі
    Білки
    Білки 3
    Білки
    Білки 2
    Білки 2
    G-білки і їх функція
    Що таке білки
    © Усі права захищені
    написати до нас
    Рейтинг@Mail.ru