Ексклюзійна хроматографія

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

Ексклюзійна хроматографія

Основні поняття
Ексклюзійна хроматографія представляє собою варіант рідинної хроматографії, в якому поділ відбувається за рахунок розподілу молекул між розчинником, що знаходяться всередині пор сорбенту, і розчинником, що протікає між його частинками.
На відміну від інших варіантів ВЕРХ, де поділ йде за рахунок різного взаємодії компонентів з поверхнею сорбенту, роль твердого наповнювача в Ексклюзійна хроматографії полягає тільки у формуванні пір певного розміру, а нерухомою фазою є розчинник, що заповнює ці пори. Тому застосування терміна «сорбент» до даних наповнювачам певною мірою умовно.
Принциповою особливістю методу є можливість поділу молекул за їх розміром в розчині в діапазоні практично будь-яких молекулярних мас - від 10 2 до 10 серпня, що робить його незамінним для дослідження синтетичних і біополімерів.
За традицією процес, що проводиться в органічних розчинниках, все ще часто називають гель-проникаючої, а у водних системах - гель-фільтраційної хроматографією. Прийнято єдиний термін, який походить від англійського «Size Exclusion» - виняток за розміром - і в найбільш повній мірі відображає механізм процесу.
Детальний розбір існуючих уявлень про дуже складної теорії процесу Ексклюзійна хроматографії проведено в монографіях. Ми розглянемо лише принципові засади методу, достатні для практичної роботи.
Обсяг Ексклюзійна колонки можна виразити сумою трьох складових:
Vс = Vо + Vi + Vd,

де Vо - мертвий об'єм - об'єм розчинника між частинками сорбенту (обсяг рухомої фази); Vi - об'єм пор, зайнятий розчинником (обсяг нерухомої фази); Vd - об'єм матриці сорбенту без урахування часу.
Повний об'єм розчинника у колонці Vt (його часто називають повним обсягом колонки, так як Vd не приймає участі в хроматографічному процесі) представляє собою суммy обсягів рухомий і нерухомої фаз:
Vt = Vо + Vi.
Утримання молекул в Ексклюзійна колонці визначається ймовірністю їх дифузії в пори і залежить від співвідношення розмірів молекул і пір, що схематично показано на рис. 2.15. Коефіцієнт розподілу Kd, як і в інших варіантах хроматографії, являє собою відношення концентрацій речовини в нерухомої і рухомої фазах:
Кd = Сi / Со.
Так як рухлива й непорушна фази мають однаковий склад, то Kd речовини, для якого обидві фази однаково доступні, дорівнює одиниці. Ця ситуація реалізується для молекул з самими малими розмірами (в тому числі і молекул розчинника), які проникають в усі пори (див. рис. 2.15) і тому рухаються через колонку найбільш повільно. Їх утримуваний об'єм дорівнює повному обсягу розчинника Vt.


Рис. 1. Модель поділу молекул за розміром в Ексклюзійна храматографіі
Всі молекули, розмір яких більше розміру пір сорбенту, не можуть потрапити в них (повна ексклюзія) і проходять по каналах між частинками. Вони елюіруются з колонки з одним і тим же дзвінком обсягом, рівним об'єму рухомої фази Vo. Коефіцієнт розподілу для цих молекул дорівнює нулю.
Молекули проміжного розміру, здатні проникати тільки в якусь частину пір, утримуються у колонці відповідно до їх розміром. Коефіцієнт розподілу цих молекул змінюється в межах від нуля до одиниці і характеризує частку обсягу пір, доступних для молекул даного розміру. Їх утримуваний обсяг визначається сумою Vo і доступній частині обсягу пір:
V R = Vo + KdVi.
Звідси випливає ще одна істотна відмінність Ексклюзійна хроматографії: в даному методі поділ закінчується до виходу піку розчинника, в той час як в інших варіантах ВЕРХ компоненти суміші елюіруются після піку розчинника.
Параметр k 'в Ексклюзійна хроматографії зазвичай не використовують. Його можна виразити рівнянням
k '= KdVi / Vo.

Для більшості сучасних сорбентів Vi ≈ Vo, тому k '≈ Kd.
Зв'язок між утримуваним об'ємом та молекулярної масою (або розміром молекул) зразка описується калібрувальної кривої (рис. 2.16). Кожен сорбент характеризується своєю калібрувальної кривої, по якій легко оцінити область поділюваних на ньому молекулярних мас. Точка А відповідає межі ексклюзії, або мертвому обсягом колонки Vo. Всі молекули, маса яких більше, ніж у точці А, будуть елюіроваться одним піком з дзвінком обсягом Vo. Точка В відбиває межа проникнення, і всі молекули, маса яких менша, ніж у точці В, також будуть виходити з колонки одним піком з дзвінком обсягом Vt. Між точками А і В розташовується діапазон селективного розділення. Відповідний йому обсяг Vi = Vt-Vo часто називають робочим об'ємом колонки. Відрізок CD являє собою лінійний ділянку калібрувальної кривої, побудованої в координатах VR-IgM. Ця ділянка описується рівнянням
Vr = C1 - C2lgM,
де C1 - відрізок, що відсікається на осі ординат продовженням відрізка СD, C2 - тангенс кута нахилу цього відрізка до осі ординат.
Величину С2 називають розділової ємністю колонки; її виражають числом мілілітрів розчинника, що припадає на один порядок зміни молекулярної маси. Чим більше розділова ємність, тим селективного розділення в даному діапазоні мас. У нелінійних областях калібрувальної кривої (ділянки АС і BD) у зв'язку зі зменшенням С2 ефективність фракціонування помітно знижується. Крім того, нелінійний зв'язок між IgM і Vr істотно ускладнює обробку даних і знижує точність результатів. Тому завжди потрібно прагнути вибирати колонку (або набір колонок) так, щоб поділ аналізованого полімеру протікало в межах лінійної ділянки калібрувальної кривої.
Якщо будь-яка речовина елюіруется з дзвінком обсягом більше Vt, то це вказує на прояв інших механізмів поділу (найчастіше адсорбційного). Адсорбційні ефекти зазвичай проявляються на жорстких сорбентах, але іноді спостерігаються і на напівжорстких гелях, мабуть, через підвищений спорідненості до матриці гелю. Прикладом може служити адсорбція ароматичних сполук на стирол-дівінілбензольних гелях.

Рис. 2. Калібрувальна крива
Радянські дослідники запропонували теорію єдиного механізму рідинної хроматографії полімерів на жорстких гелях, з якої випливає, що зміною параметрів взаємодії в системі полімер - сорбент - розчинник можна переходити від адсорбційного механізму до Ексклюзійна і навпаки. У загальному випадку в Ексклюзійна хроматографії потрібно прагнути повністю придушити адсорбційні та інші побічні ефекти, так як вони, особливо при дослідженні молекулярно-масового розподілу (ММР) полімерів, можуть істотно спотворити результати аналізу.
Принциповими відмінностями Ексклюзійна хроматографії від інших варіантів є заздалегідь відома тривалість аналізу в конкретній використовуваної системі, можливість передбачення порядку елюювання компонентів за розміром їх молекул, приблизно однакова ширина піків у всьому діапазоні селективного розділення і впевненість у виході всіх компонентів проби за досить короткий проміжок часу, відповідний обсягом Vt. Хоча даний метод застосовують, головним чином, для дослідження ММР полімерів та аналізу макромолекул біологічного походження (білки, нуклеїнові кислоти і т.д.), зазначені особливості роблять його надзвичайно перспективним для аналізу низькомолекулярних домішок в полімерах та попереднього розділення проб невідомого складу. Отримана при цьому інформація суттєво полегшує вибір найкращого варіанту ВЕРХ для аналізу даної проби. Крім того, мікропрепаратівное Ексклюзійна поділ часто використовують у якості першого етапу при поділі складних сумішей шляхом комбінації різних видів ВЕРХ.
Обмежений діапазон коефіцієнтів розподілу визначає і головний недолік Ексклюзійна хроматографії - помітно менше, ніж в інших варіантах ВЕРХ, число піків, які можуть бути повністю розділені на колонці заданої ефективності. Проте останнім часом завдяки успіхам досягнутим в технології виготовлення високоефективних колонок, цей метод все ширше застосовують і для розділення малих молекул.
Особливості апаратури
Апаратура для Ексклюзійна хроматографії принципово нічим не відрізняється від тієї, яку використовують в інших видах ВЕРХ. Ексклюзійна поділ можна здійснити на будь-якому рідинному хроматографі, встановивши в нього відповідні колонки. Характеристики апаратури впливають головним чином на точність одержуваних результатів. Специфічними для даного методу є тільки деякі детектори та особливі вимоги до систем обробки даних.
З усіх варіантів ВЕРХ у Ексклюзійна хроматографії полімерів пред'являються найбільш жорсткі вимоги до стабільності потоку рухомої фази. Тому потрібно використовувати насосні системи з точністю подачі не гірше 0,3-0,5%. У кращих насосах, розроблених спеціально для даного методу, нестабільність швидкості потоку знижена до 0,1%.
Між дозатором і колонками дуже бажано встановлювати фільтр з мінімальним мертвим обсягом, так як забивання вхідного фільтра колонки при аналізі полімерів відбувається набагато частіше, ніж в інших видах ВЕРХ.
Точність результатів у екоклюзіонной хроматографії полімерів помітно залежить від температури. При її зміні на 10 ° С помилка визначення середніх молекулярних мас перевищує ± 10% [23]. Тому в даному варіанті ВЕРХ термостатування розділової системи обов'язково.
Дозатор і колонки зазвичай розміщують в одному термостаті. Як правило, достатня точність підтримки температури ± 1 ° С в межах до 80-100 ° С. У деяких випадках, наприклад, при аналізі поліетилену і поліпропілену, робоча температура становить 135-150 ° С. Необхідно також вживати заходів для запобігання помітних змін температури в лінії, що з'єднує колонку з детектором. При робочих температурах до 40-50 ° С і довжині лінії 5-8 см її доцільно виготовляти з фторопластового капіляра з зовнішнім діаметром близько 1,5 мм, внутрішнім - 0,3 мм. При більш високих температурах потрібно термостатування капіляра.
Найбільш поширеним детектором в Ексклюзійна хроматографії полімерів є диференціальний рефрактометр. При роботі з цим детектором слід пам'ятати, що в діапазоні приблизно до 5 ⋅ 10 3 -5 ⋅ 10 4 його сигнал залежить від молекулярної маси полімеру. Тому при дослідженні полімерів, що містять значну кількість низькомолекулярних фракцій, в процесі обробки результатів потрібно вводити відповідні поправки або, якщо це можливо, проводити спеціальну калібрування детектора. З детекторів, розроблених спеціально для аналізу полімерів, слід згадати віскозіметріческій детектор і проточний лазерний нефелометр (детектор малокутового лазерного світлорозсіювання). Ці детектори в комбінації з рефрактометром або іншим концентраційним детектором дозволяють безперервно визначати молекулярну масу полімеру в елюент. При їх використанні відпадає необхідність калібрування розділової системи по досліджуваного полімеру, але обробка інформації може здійснюватися тільки на ЕОМ. Віскозіметріческій детектор, крім того, є дуже зручним приладом для дослідження длінноцепной розгалуженості синтетичних полімерів.
Звичайні електронні інтегратори, використовувані в ВЕРХ індивідуальних сполук, непридатні для обробки даних, одержуваних при Ексклюзійна хроматографії полімерів. Для цієї мети використовують міні-комп'ютери, які виконують за спеціальними програмами необхідні обчислення і видають результати визна-
лення у вигляді середніх молекулярних характеристик або кривих ММР. Сучасні прилади можуть бути оснащені додатковими пристроями для повної автоматизації аналізу. Застосування автоматичних дозаторів у поєднанні з міні-комп'ютером дозволяє виконувати різні калібрування, видавати у необхідній формі дані по ММР, проводити їх статистичний аналіз без участі операторів.
Як зазначалося вище, в даний час аналіз полімерів проводять в основному на звичайній хроматографічної апаратурі. Однак існують і спеціальні прилади, призначені переважно для визначення ММР полімерів. До них належить, зокрема, мікрогельхроматограф ХЖ-1309. Технічні характеристики хроматографа наведені в додатку 14.6. Цей унікальний прилад оснащений високочутливим лазерним рефрактометром з місткістю кювети 0,1 мкл [24] і микроколонки діаметром 0,5 мм з ефективністю близько 30 тис. т. т. / м. Тривалість аналізу становить 5-10 хв, а витрата розчинника - приблизно 100 мкл на один аналіз, що дозволяє працювати з особливо дефіцитними і сверхочіщеннимі розчинниками. Калібрування приладу і обробку результатів проводять на ЕОМ з пакетом програм, що забезпечують виконання будь-яких розрахунків, необхідних в Ексклюзійна хроматографії полімерів.
Вибір сорбенту
Вибір сорбентів, що забезпечують оптимальні умови для вирішення конкретної аналітичної задачі, проводять у кілька етапів. Спочатку на основі даних про хімічний склад або розчинності аналізованих речовин встановлюють, який варіант процесу слід застосувати - хроматографію в водних системах або в органічних розчинниках, що значною мірою визначає тип необхідного сорбенту. Поділ речовин низької і середньої полярності в органічних розчинниках можна успішно здійснити як на напівжорстких, так і на твердих гелях. Дослідження ММР гідрофобних полімерів, що містять полярні групи, частіше проводять на шпальтах зі стирол-дівінілбензольнимі гелями, тому що в цьому випадку практично не виявляються адсорбційні ефекти і не потрібно добавка модифікаторів до рухомій фазі, що значно спрощує підготовку і регенерацію розчинника.
Для роботи у водних системах використовують головним чином жорсткі сорбенти, іноді дуже хороші результати вдається отримати на напівжорстких гелях спеціальних типів. Потім за калібрувальним кривим або даними про діапазоні фракціонування, наведеним у гол. 4, вибирають сорбент потрібної пористості з урахуванням наявних відомостей про молекулярної маси зразка. Якщо аналізована суміш містить речовини, що відрізняються за молекулярною масою не більше ніж на 2-2,5 порядку, то зазвичай вдається розділити їх на колонках з одним розміром пор. При більш широкому діапазоні мас слід використовувати набори з декількох колонок з сорбентами різної пористості. Орієнтовно калібрувальну залежність в цьому випадку отримують складанням кривих для окремих сорбентів.
На обраних таким чином колонках виконують пробний аналіз і при необхідності вносять зміни до системи колонок для оптимізації розділення. Оптимізацію доводиться проводити, якщо колонки не забезпечують необхідного діапазону поділу або ефективності поділу.
Найбільш складним є вибір системи колонок для поділу синтетичних полімерів, що мають широке ММР. Зазвичай для цієї мети застосовували набори з трьох - п'яти колонок, що містять сорбенти з послідовно зростаючим розміром пор
(Наприклад, μ-стірогель 102 +103 +104 +105 ⊕) *, області поділу яких перекриваються. При цьому, як правило, отримували калібрувальну залежність з лінійним діапазоном близько трьох порядків і з досить великими криволінійними ділянками, а тривалість аналізу (при найбільш типовою швидкості потоку 1 мл / хв) становила 40-45 хв. Головним недоліком даної калібрування є суттєве погіршення селективності розділення на криволінійних ділянках, що помітно знижує точність результатів. Крім того, різко ускладнюється обробка експериментальних дан-них. Тому особливе значення має вибір такої роздільної системи, яка характеризується лінійною залежністю логарифма молекулярної маси полімеру від утримуваного обсягу. У цьому випадку можна розглядати хроматограму як дзеркальне відображення диференціальної кривої ММР в логарифмічному масштабі.
Запропоновано принцип бімодального розподілу розмірів пор, який дозволяє складати набори колонок із значно кращими робочими характеристиками. Відповідно до цього принципу, для складання набору колонок з лінійною калібрувальної залежністю в широкому інтервалі молекулярних мас потрібно використовувати тільки два сорбенту з розмірами пор, що відрізняються на один-півтора порядку і мають помірно вузький розподіл пор за розміром. Розділова ємність З 2 колонок з цими сорбентами повинна бути приблизно однаковою. Отримані бімодальний набори колонок, як правило, мають лінійний ділянку калібрувальної кривої, що перекриває близько чотирьох порядків зміни молекулярної маси, і помірну роздільну здатність. За рахунок скорочення числа колонок відповідно зменшується тривалість поділу. Так, бімодальний набори, що випускаються фірмою «Дюпон» і складаються з колонок з зорбаксамі PSM-60 і PSM-1000 довжиною по 25 см, мають лінійну калібрування в діапазоні молекулярних мас від 2-10 2 до 10 6 і гарантовану ефективність не менше 20 000 т. т.
Подальші дослідження показали, що необхідний розподіл пір сорбенту за розмірами, що забезпечує лінійну калібрування в будь-якому заданому діапазоні молекулярних мас, в загальному випадку є мультимодальних і може бути розраховане на ЕОМ.
Таким чином, маючи кілька сорбентів різної пористості з відомим розподілом пор за розміром, можна розрахувати складу змішаного «лінійного» сорбенту.
Так, калібрувальна залежність трімодального сорбенту на основі макропористий стекол в діапазоні молекулярних мас від 2-10 3 до 4-10 травні мала значно більш високу ступінь лінійності, ніж у бімодальних наборів, описаних в роботі.
Лінійні набори можна складати і з колонок з напівжорсткими гелями. Наведемо приклад складання лінійного набору з колонок з стірогелямі в тому випадку, коли роздільна ємність першої колонки помітно менше, ніж другий. Отримана калібрувальна залежність являє собою ламану лінію з точкою зламу, відповідної молекулярної маси близько 20 000 (верхня межа селективного діапазону першої колонки). При підключенні ще однієї колонки з розміром пір 500 Д розділова ємність у діапазоні мас до 20 000 збільшилася приблизно вдвічі, а калібрувальна залежність набору стала практично лінійною в діапазоні молекулярних мас від 5-10 2 до 2-10 6.
На думку Йоу з співр., Колонки з жорсткими гелями краще підходять для поєднання в бімодальному набори, так як властивості цих сорбентів більш стабільні від партії до партії. Однак слід зазначити, що в останні роки якість колонок з напівжорсткими гелями і відтворюваність їх характеристик значно покращилися. Відзначено, що сучасні полімерні сорбенти більш однорідні за розмірами пір, ніж сорбенти на основі силікагелів [28]. Досвід роботи одного з авторів з колонками типу ц-сферогель показав, що з'єднання різних колонок необхідної пористості, взятих «через одну» (наприклад, 5-10 2 +10 4 0 або 10 березні +10 5 0), в більшості випадків дозволяє отримати лінійну калібрувальну залежність в діапазоні близько 4 порядків.
Оптимізацію розділової системи доцільно розглянути на прикладі дослідження зразка, про який не відомо нічого, крім розчинності (у воді або в органічному розчиннику). Попереднє поділ зразка проводять на бімодальному наборі колонок з широким діапазоном поділу. Залежно від виду одержуваної хроматограми (рис. 3) змінюють розділову систему відповідно до рекомендацій, наведених нижче.
1. Набір оптимальний.
2. Недостатній діапазон поділу: є високомолекулярні фракції, які потрапляють в область ексклюзії. Необхідно додати колонку з більш великими порами.
3. Є фракції, які потрапляють в область ексклюзії; колонка II не бере участь у поділі. Необхідно замінити її на колонку з більш великими порами, ніж у колонки I.


Рис. 3. Різні види хроматограм невідомого зразка: 1 - область поділу великопористої колонки; 2 - область поділу дрібнопористою колонки
4. Колонка II не бере участь у поділі. Слід використовувати дві колонки типу I.
5. Поліпшення поділу можна отримати на двох колонках із середнім розміром пор.
6. Недостатня селективність розділення; колонка I не бере участь у поділі.
Слід використовувати дві колонки типу II.
Якщо в будь-якому з розглянутих варіантів необхідно підвищити ефективність розділення, то слід подвоїти число колонок, що входять у вибраний набір.
Описаний процес оптимізації не враховує особливостей, пов'язаних з адсорбцією аналізованих речовин та іншими побічними явищами. Усунення адсорбції за рахунок модифікації рухомої фази розглянуто нижче.
Для запобігання специфічних труднощів, що виникають при Ексклюзійна хроматографії біололімеров, вітамінів і різних лабільних сполук, останнім часом найчастіше використовують сорбенти з прищепленої карбогідратних (типу діол) або ефірною фазою (μ-бондагель Е) і полімерні сорбенти, призначені для роботи у водних середовищах .
Вибір розчинника
Розчинники, які застосовуються в Ексклюзійна хроматографії, повинні відповідати таким основним вимогам:
1) повністю розчиняти зразок при температурі поділу;
2) змочувати поверхню сорбенту і не погіршувати ефективність колонки;
3) запобігати адсорбцію (та інші взаємодії) поділюваних речовин з поверхнею сорбенту;
4) забезпечувати максимально високу чутливість детектування;
5) мати низьку в'язкість і токсичність.
Крім того, при аналізі полімерів має істотне значення термодинамічна якість розчинника: дуже бажано, щоб він був «хорошим» по відношенню до поділюваного полімеру і матриці гелю. Властивості, найбільш поширених розчинників для Ексклюзійна хроматографії наведено в додатку 2.
Розчинність зразка зазвичай є головним лімітуючим фактором, що обмежує асортимент придатних рухливих фаз. У додатку 3 вказані основні типи полімерів, які доцільно аналізувати в тих чи інших розчинниках.
Найкращим органічним розчинником для Ексклюзійна хроматографії синтетичних полімерів за комплексом властивостей є тетрагідрофуран. Він володіє унікальною здатністю розчинювальною, низькою в'язкістю і токсичністю, краще за багатьох інших розчинників сумісний зі стирол-дивинил-бензоловими гелями і, як правило, забезпечує високу чутливість детектування при використанні рефрактометра або УФ-детектора в області до 220 нм. Для аналізу високополярних і нерозчинних у тетрагідрофурані полімерів (поліаміди, поліакрилонітрил, поліетилен-терефталат, поліуретани та ін) зазвичай використовують диметилформамід чи м-крезол, а поділ полімерів низькою полярності, наприклад різних каучуків і полісілоксанов, часто проводять у толуолі або хлороформі. Останній є також одним з кращих розчинників при роботі з ІЧ-детектором. О-Діхлорбензол і 1,2,4 - трихлор-бензол застосовують для високотемпературної хроматографії поліолефінів (зазвичай при 135 ° С), які в інших умовах не розчиняються. Ці розчинники мають дуже високий показник заломлення, тому іноді їх доцільно використовувати замість тетрагідрофуран для аналізу полімерів з низьким коефіцієнтом заломлення, що дозволяє підвищити чутливість при детектуванні рефрактометром.
Для запобігання окислення розчинників і напівтвердих гелів в умовах високотемпературної Ексклюзійна хроматографії до про-діхлорбензолу і 1,2,4 - трихлор-бензолу додають антиокислювачі - 1,3 г / л 2,6 - ді-mреm-бутил-4-метілфенола (алко -фен БП, іонол) або 0,4 г / л 4,4 /-тіo-біc (6 - трет-бyтіл-3-метілфенол) а (тіоалкофен БМ, сантонокс R).
Жорсткі сорбенти сумісні з будь-якими рухомими фазами, що мають рН <8-8,5; при більш високих значеннях рН силікагель починає розчинятися і колонка необоротно втрачає ефективність. Стирол-дівінілбензольние гелі сумісні в основному з
елюентом помірної полярності. Для роботи на колонках з μ-стірогелем (від 10 3 ⊕ і вище), за даними фірми «Уотерс», придатні тетрагідрофуран, ароматичні і хлоровані вуглеводні, гексан, циклогексан, діоксану, тріфторетанол, гексафтор-пропанол і діметилформамід.
Ступінь набухання частинок гелю в різних розчинниках неоднакова, тому заміна елюента в колонках з даними сорбентами може призвести до зниження ефективності за рахунок зміни обсягу гелю і утворення порожнин. При використанні невідповідних розчинників (ацетон, спирти) відбувається настільки сильна усадка гелю, що колонка виявляється безнадійно зіпсованою. У сорбентів з малим розміром пор (типу μ-стірогеля 100 ⊕ і 500 ⊕) така усадка спостерігається як у полярних, так і в неполярних розчинниках, тому з ними, крім того, не можна працювати в насичених вуглеводнях, фторованих спиртах та диметилформаміді. Зручним, хоча і дуже дорогим виходом з положення є використання окремих наборів колонок для кожного застосовуваного розчинника. Деякі фірми з цією метою випускають колонки з одним і тим же розміром пір, заповнені різними розчинниками - тетрагідро-фуранів, толуолом, хлороформом і диметилформамидом.
Для запобігання усадки гелю рекомендується наступний спосіб заміни розчинника: колонку, що містить розчинник А, приєднують до насоса, встановлюють швидкість потоку розчинника А 0,3-0,5 мл / хв, проводять градієнтне зміна складу елюента від 0 до 100% розчинника У зі швидкістю 1% / хв і промивають з тією ж швидкістю розчинником У протягом 1,5-2 ч. Різка зміна полярності розчинника майже завжди призводить до погіршення характеристик колонки, і його краще взагалі уникати. Якщо така заміна все ж необхідна, то слід використовувати проміжний розчинник. Так, толуол спочатку замінюють на тетрагідрофуран і через 1-2 дні - на диметилформамід. Падіння ефективності при цьому буде менше, ніж при одностадійної заміні розчинника. У будь-якому випадку заміна рухомої фази у високо-
ефективних колонках з напівжорсткими гелями залишається дуже делікатній операцією, що вимагає особливої ​​обережності. У принципі можливе приготування таких колонок і для роботи з полярними розчинниками. Потрібний розчинник при цьому використовують при набиванні колонки. Однак внаслідок малої набухання гелів у цих розчинниках одержувані колонки зазвичай мають більш низьку ефективність.
При поділі макромолекул основний внесок у розмивання смуги визначається утрудненою массопередачи. На жаль, багато хто з застосовуваних елюентом мають високу в'язкість. Для зниження в'язкості (а також для поліпшення розчинності) екс-клюзіонную хроматографію часто проводять при підвищених температурах, що істотно покращує ефективність хроматографічної системи.
Аналіз більшості полімерів на жорстких гелях часто ускладнюється їх адсорбцією. Для придушення адсорбції зазвичай використовують розчинники, які адсорбуються на насадці колонки сильніше, ніж аналізовані речовини. Якщо з яких-небудь причин це неможливо, то рухливу фазу модифікують добавкою 0,1-2% полярного модифікатора, наприклад тетрагідрофуран. Значно більш сильними модифікаторами є етиленгліколь та полигликоли з різною молекулярною масою (ПЕГ-200, ПЕГ-400, карбовакс 20 М). Іноді, наприклад при аналізі полікіслот в диметилформаміді, потрібно добавка досить сильних кислот. Слід зазначити, що повністю усунути адсорбцію добавкою модифікаторів вдається не завжди. У таких випадках потрібно використовувати напівтверді гелі. Деякі полімери добре розчиняються тільки у високо полярних розчинниках (ацетон, диметилсульфоксид і т.п.), несумісних зі стирол-дівінілбензольнимі гелями. При їх поділі на жорстких сорбентах вибір розчинника проводять відповідно до загальних принципів, викладених вище.
Інша ситуація має місце при проведенні Ексклюзійна хроматографії у водних середовищах. Через специфічних особливостей багатьох поділюваних систем (білки, ферменти, поліелектроліти тощо) і різноманітності застосовуваних сорбентів існує дуже багато варіацій складу рухомої фази для придушення різних небажаних ефектів. Спільними прийомами модифікації є добавка різних солей і застосування буферних розчинів з певним значенням рН. Зокрема, підтримку рН = <4 дає можливість придушити слабку іонообмінну активність силікагелів, обумовлену присутністю на їх поверхні кислих силанольних груп. Необхідна іонна сила рухомої фази досягається при концентрації буферного розчину 0,05-0,6 М; оптимальну концентрацію підбирають експериментально. Для запобігання іонообмінної сорбції катіонних сполук найбільш часто використовують такий активний модифікатор, як тетраметіламмонійфосфат при рН ≅ 3. Однак при поділі деяких білків можуть проявлятися гідрофобні взаємодії, у свою чергу ускладнюють Ексклюзійна механізм поділу. Ті ж ефекти іноді виявляються і при роботі з дезактивовані гідрофільними сорбентами. Для їх усунення до розчинника додають метанол. Іноді у водне рухливу фазу вводять полярні органічні розчинники, полигликоли, кислоти, основи і поверхнево-активні речовини.

Література
1. Aleksandrov ML ea / J. High Resol. Chromatogr. Commun, 1983, v. 6, No. 11, p. 629-631.
2. Yau W., Grinnard G., Kirkland /. / J. Chromatogr., 1978, v. 149, p. 465.
3. Виленчик Л. 3. і dp. / Високомол. соед., 1980, т. А22, № 11, с. 2801-2804.
4. Нестеров В.В. і dp. / Високомол. соед., 1984, т. Б26, № 3, с. 163-167.
5. Benson JR, Woo D. /. / J. Chromatogr. Sci, 1984, v. 22, No. 9, p. 386 - 399.
6. Zdanov SP ea / J. Chromatogr, 1973, v. 77, No. 2, p. 149-159.
7. Schlechter /. / Anal. Biochem, 1974, v. 58, No. 1, p. 30.
8. Нефедов П.П. і dp. / Високомол. соед, 1981, т. А23, № 5, с. 943-950.
9. Nakamura К., Endo R. / J. Appl. Polym. Sci, 1981, v. 26, p. 2657-2664.
10. Іціксон Л.Б., Філіппов А.А. / / В кн.: Ill Всесоюзний симпозіум з молекулярної рідинної хроматографії, тези доповідей. Рига, вид. Інституту органічного. синтезу АН Латв. РСР, 1984, с. 126-127.
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Хімія | Реферат
56кб. | скачати


Схожі роботи:
Хроматографія
Лігандообменная хроматографія
Адсорбційна хроматографія
Іонообмінна хроматографія 2
Іонообмінна хроматографія
Газова хроматографія
Іонно-парна хроматографія
Іонно парна хроматографія
Іонна хроматографія Добавка електроліту
© Усі права захищені
написати до нас
Рейтинг@Mail.ru