Взаємодії білків з РНК структурний комп`ютерний аналіз

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.


Нажми чтобы узнать.
скачати

Міністерство освіти Російської Федерації
Самарський Державний Університет
КАФЕДРА БІОХІМІЇ
Взаємодії білків з РНК -
структурний комп'ютерний аналіз
Курсова робота
СПЕЦІАЛЬНІСТЬ: 011600 "БІОЛОГІЯ"
СПЕЦІАЛІЗАЦІЯ: "БІОХІМІЯ"
Виконала студентка
4 курсу, 541 групи
Ревтович Світлана
Володимирівна
Підпис_____________
Науковий керівник
доктор біологічних
наук професор
Подковкін Володимир
Георгійович
Підпис_____________
Курсова робота захищена
на засіданні кафедри:
"____"___________ 1999р
Оценка______________
Завідувач кафедрою
кандидат біологічних
наук доцент
Фролов Юрій Павлович
Підпис_____________
Самара 2001
Зміст:
 
"1-3" Вступ. 3
1. Огляд літератури .. 4
1.1. Відмінності ДНК-білкових від РНК-білкових взаємодій. 4
1.2. Ранні уявлення про РНК-білкових взаємодіях. 6
1.2.1. РНК-зв'язуючі структурні мотиви в білках. 6
1.2.2. Взаємодії білків з тРНК .. 8
1.2.3. Взаємодії білків з матричними РНК .. 9
1.2.4. Взаємодії білків з рРНК .. 9
1.3. Сучасні методи дослідження РНК-білкових взаємодій. 11
1.3.1. Біохімічні методи .. 11
1.3.2. Фізичні методи .. 14
2. Експериментальна частина. 16
2.1. Матеріали та методи дослідження. 16
2.1.1. Метод молекулярного заміщення. 16
2.1.2. Збір та обробка дифракційних даних. 23
2.1.3. Рішення проблеми фаз. 24
2.1.4. Побудова та уточнення моделі. 24
2.2. Результати та їх обговорення. 25
Висновки: 29
Список літератури .. 30

Введення


1. Огляд літератури


1.1. Відмінності ДНК-білкових від РНК-білкових взаємодій


Подвійна спіраль ДНК - це регулярна структура, в якій найбільш суттєві відмінності між сусідніми ділянками укладені в послідовності пар основ. В обох жолобках специфічний сайт ДНК для впізнання білком може бути сформований мережею водневих зв'язків між основами нуклеотидів. Великий жолобок спіралі ДНК доступніше для контакту, що створює можливість для дискримінації послідовностей у ньому [39]. Заснований на цьому припущенні механізм впізнавання «прямим зчитуванням» був підтверджений для багатьох ДНК-зв'язуючих білків. Також було відзначено потенційне значення і «непрямого зчитування». Деякі послідовності ДНК можуть мати зміни в конформації цукрово-фосфатного остову або навіть бути деформовані в незвичайні структури. У такому випадку специфічність зв'язування може визначатися контактами білка з ланцюгом [40]. Індуковані білком порушення структури ДНК звичними і можуть варіювати за формою від невеликих вигинів, як в сайті нуклеази EcoRI, до великих вигинів і виведення основ з стекінгу, як у комплексі з ТАТА-зв'язує білком [24].
Механізм «прямого зчитування» припускає, що ДНК-білковими контактами, визначальними специфічність зв'язування, є водневі зв'язки з підставами і гідрофобні контакти з тимінових метилом, в той час як енергія неспецифічного зв'язування забезпечується іонними та водневими зв'язками з цукрово-фосфатним остовом. У «непрямому зчитуванні» можуть брати участь і інші види взаємодій, наприклад, у комплексі з ТАТА-зв'язує білком ДНК контактує з гідрофобною білкової поверхнею і ароматичні амінокислоти інтеркалює в спіраль ДНК [24].
Молекули РНК відрізняються від ДНК кількома особливостями, які впливають на можливості білкового пізнавання. По-перше, в РНК ділянки Уотсон-Криковського спіралей часто перериваються випинаннями, внутрішніми петлями і шпильками. Дослідження часто зустрічаються, «четирехнуклеотідних» шпильок і консервативних внутрішніх і шпилькових петель Хвороби, методами ЯМР і рентгеноструктурного аналізу виявили специфічні нерегулярні структури, що містять неканонічні пари і випинання. По-друге, спіралі РНК досить короткі, зазвичай менше повного обороту, і мають А-форму, відмінну від В-форми ДНК. А-форма спіралі має дуже глибокий і вузький великий жолобок, що створює стеричні утруднення для взаємодії з білками. Однак прилеглий до нерегулярних ділянкам великий жолобок може бути доступний для зв'язування [41].
Наслідком цих відмінностей є те, що білки виявляються перед значно більшою розмаїтістю водневих зв'язків і можливостей стекінгу нуклеотидів у разі РНК, ніж це можливо в стандартній спіралі ДНК. Додатковою і вельми важливою особливістю РНК є можливість «теоретичних» взаємодій, які можуть з'єднувати різні ділянки РНК і створювати складні структури. Класичними прикладами є з'єднання спіралей тРНК в «L-образну» молекулу, виявлена ​​в інтрони групи I «аденозинових платформа», що відкриває спіраль РНК для стекінгу з іншого спіраллю РНК [12], і структура двох взаємодіючих петлями транскриптів RNA I і RNA II плазміди ColE1 , так званий «kissing» комплекс [27]. Той факт, що завдяки вторинним і третинним взаємодіям може бути створена унікальна структура РНК, підвищує ймовірність специфічної взаємодії білків тільки з цукрово-фосфатним остовом. Ця ситуація може бути крайнім випадком «непрямого зчитування», коли основи нуклеотидів забезпечують білкове впізнавання тільки визначенням загальної конформації РНК, а не прямими контактами з білком.
Таким чином, спотворення регулярної структури нуклеїнової кислоти, по всій видимості, більш важливо для впізнавання РНК, ніж для ДНК. Спіраль ДНК досить стабільна структура, в той час як неспарені нуклеотиди і петлі дестабілізують структуру РНК. Комбінація багатого вибору нерегулярних структур у РНК та можливості деформації її структури дозволяють припустити, що РНК-зв'язуючі білки будуть використовувати більш широкий вибір стратегій зв'язування, ніж ДНК-зв'язуючі білки, і що механізм впізнавання «непрямим зчитуванням» буде серед них більш широко поширений.

1.2. Ранні уявлення про РНК-білкових взаємодіях


1.2.1. РНК-зв'язуючі структурні мотиви в білках


Вивчення властивостей РНК-зв'язуючих білків призвело до виявлення в цих білках ряду і консервативних мотивів. Їх відкриття дозволило розпочати класифікацію РНК-зв'язуючих білків, виходячи з їхніх структурних особливостей, а також передбачати РНК-зв'язуючі властивості білків [8]. В даний час виділяють наступні основні мотиви:
1) РНП (ribonucleoprotein) мотив - найбільш поширений, складається з двох коротких послідовностей РНП1 (октамер) і РНП2, розділених приблизно 30 амінокислотами [17].
2) S1 мотив - до складу входить п'ять антипаралельних b-тяжів. Ряд консервативних ароматичних і заряджених амінокислот, розташованих в петлі між тяжами b1 і b2, в середині b2, в кінці b3 і в повороті між b4 і b5 знаходяться поблизу один від одного і, ймовірно, формують РНК-зв'язуючий ділянку домену [10].
3) Домен холодового шоку - складається з п'яти b-тяжів з РНП-послідовністю, розташованої в одному з тяжів і структурно дуже схожий з S1 мотивом [38].
4) КН мотив - містить стабільну baabba структуру. [11] Точна роль мотиву в РНК-зв'язуванні невідома.
5) Мотив DSRM - має abbba топологію. Можливий ділянку зв'язування знаходиться в петлі між b-тяжем і С-кінцевий a-спіраллю [9].
6) RGG мотив - містить 20-25 амінокислот і зазвичай є в комбінації з РНК-зв'язуючими мотивами інших типів. Він складається з близько розташованих поворотів Arg-Gly-Gly (RGG), розташованих серед інших, часто ароматичних амінокислот [8].
7) Мотив ARM - складається з 10-20 амінокислот з великою кількістю аргінонов. Зустрічається у вірусних і фагових білках.
8) Домени з «цинковими пальцями» - містить послідовності СХ4СХ12НХ3-4Н і відповідне число іонів цинку, пов'язані цистеїнами і гістидину [17].
9) Інші РНК-зв'язуючі мотиви. Існує ряд інших консервативних послідовностей, що не мають гомології з вже перерахованими мотивами. Наприклад, мотив білка-аттенюатора триптофанового оперона з B. Subtilis. [2].

1.2.2. Взаємодії білків з тРНК


Питання про те, як аміноацил-тРНК-синтетази досягають високої специфічності у впізнавання тРНК, ймовірно, був одним з перших серйозно досліджуваних питань у проблемі РНК-білкових взаємодій. Щоб взаємодіяти з усіма компонентами трансляційного апарату, все тРНК повинні мати достатньо схожу тривимірну структуру, що значно ускладнює для кожної з 20 синтетаз вибір своїх ізоакцепторними тРНК з пулу тРНК клітини. У зв'язку з цим, можливості до дискримінації дуже обмежені і, в основному, зведені до впізнавання нуклеотидів в специфічних позиціях.
До теперішнього часу визначено елементи впізнавання для 19 з 20 синтетаз. Виявилося, що вони неоднакові для різних синтетаз. Більшість цих ферментів дізнається одну або більше з трьох наступних детермінант:
1) щонайменше, один нуклеотид в антикодоном;
2) одну або більше з останніх трьох пар нуклеотидів акцепторного стебла;
3) так зване «Дискримінаторні» підстава між акцепторним стеблом і ССА кінцем.
Крім того, принаймні, 8 синтетаз використовують і інші відмітні ознаки.
Елемент впізнавання може впливати на специфічність аміноацілірованія тРНК, тому що він впізнається «правильної» синтетазою (позитивний елемент) або тому що запобігає взаємодія з «не своєї» синтетазою (негативний елемент). Негативний елемент може маскувати присутність позитивних елементів [32]. Яскравою ілюстрацією цього факту є набори з трьох елементів специфічності близько ССА кінця тРНК для аланіну, гістидину і гліцину. Кожна детермінанта є позитивним елементом для однієї або двох синтетаз і негативним для інших [19].
Незважаючи на виконання однієї і тієї ж реакції аміноацілірованія, синтетази можуть здійснювати різне зв'язування з субстратом реакції - тРНК, причому елементи впізнавання тРНК не завжди є унікальними, а можуть мати структурний подібність з іншими класами білків.

1.2.3. Взаємодії білків з матричними РНК


Механізм мРНК-білкових впізнавання є, мабуть, найменш вивченим питанням у проблемі РНК-білкових взаємодій, з причини відсутності структур, вирішених з достатньо високою роздільною здатністю (виняток - комплекс L30-мРНК).
Однак, спираючись на дані отримані методом ядерного магнітного резонансу було зроблено припущення, що основну роль у процесі мРНК-білкового впізнавання грають наведені раніше консервативні мотиви. Наприклад, RNP1 і RNP2 (білок U1A), домен холодового шоку і гідрофільний С-кінцевий домен з чергуються кластерами негативно і позитивно заряджених амінокислотних залишків (Y-box-білки).

1.2.4. Взаємодії білків з рРНК


Взаємодії білків з рРНК дуже сильно відрізняються від взаємодій білків з ДНК і тРНК. Місця зв'язування білків на ДНК і тРНК характерні наявністю специфічної еволюційно консервативної послідовності нуклеотидів, заміна яких призводить до сильного ослаблення або зникнення взаємодій [1]. Припущення про визначальну роль послідовності нуклеотидів в РНК-білковому розпізнаванні, засноване на дослідженнях комплексів білків-репрессором з ДНК і вивченні аміноацил-тРНК-синтетаз, виявляється некоректним стосовно рРНК-білковим комплексам. Оскільки структура ДНК регулярна, саме послідовність підстав, а не конформація кістяка, визначає специфічність зв'язування. Подібне ж можна сказати про комплекси аміноацил-тРНК-синтетаз з відповідними тРНК, оскільки просторові структури тРНК однотипні і специфічність впізнавання залежить саме від послідовності основ у певних ділянках молекули тРНК.
рРНК, на відміну від ДНК і тРНК, містить багато нерегулярних ділянок, і рибосомні білки можуть впізнавати специфічні конформації, утворені сахарофосфатним остовом таких ділянок. Місця зв'язування рибосомних білків на рРНК можна розділити на дві групи [18]. До першої належать дволанцюжкові спіралі довжиною до 40 нт, що містять випетліванія (loops) або опуклості (bulges), які або спотворюють структуру спіралей нормальної А-форми, утворюючи унікальні конформації, пізнавані білком, або ж самі формують місця зв'язування. Друга група містить домени рРНК, що мають складну просторову структуру, взаємне розташування сегментів якої стабілізується рибосомного білка.
Для пошуку передбачуваних місць РНК-білкового зв'язування в молекулах рибосомних білків використовують дві концепції:
1. Наявність кластерів еволюційно консервативних позитивно заряджених або ароматичних амінокислотних залишків у структурах білків може служити вказівкою на функціональну важливість даної області молекули при взаємодії з рРНК;
2. Здатність рибосомних білків до специфічних перехресним взаємодією з рРНК з еволюційно віддалених організмів дозволяє використовувати порівняння структур гомологічних білків для локалізації можливих місць зв'язування рРНК і говорити про консерватизм просторової структури РНК-білкового інтерфейсу [31].
Додатково використовують модифікації білка генно-інженерними або біохімічними методами, які полягають в заміні або хімічної модифікації амінокислотних залишків або ж у видаленні частини поліпептидного ланцюга з подальшою перевіркою константи зв'язування.

1.3. Сучасні методи дослідження РНК-білкових взаємодій


1.3.1. Біохімічні методи


До біохімічним методам ставляться визначення констант зв'язування на фільтрах, рухливість в гелі та центрифугування в градієнті сахарози.
 
1.3.1.1. Зв'язування на фільтрах

Є стандартно використовуваної методикою для визначення РНК-білкових взаємодій та оцінки константи зв'язування. Принцип даного методу заснований на здатності нітроцелюлозних фільтрів утримувати білки, а також пов'язані РНК, поки незв'язані РНК проходять через фільтр. Незважаючи на свою концептуальну простоту, метод все ж не є досить надійним і не підходить для вивчення деяких РНК-білкових комплексів: він добре працює для порівняно невеликих молекул РНК, великі ж молекули РНК-білкових комплексів часто не утримуються.
Методика полягає в тому, що еквімолярної кількості радіоактивної РНК змішуються з білком в різної концентрації і фільтруються через нітроцелюлозні фільтри. В ідеалі при високій концентрації білка повинне утримуватися до 100% РНК, в дійсності ж цей відсоток значно менше. Крім того, білкові фракції також можуть не утримуватися фільтром. Наприклад, при аналізі взаємодії білка L18 з 5S рРНК було виявлено, що ефективність зв'язування комплексу 5SрРНК-L18 становила 35% при утриманні 65% білка L18, і <5% для вільної 5S рРНК. Тим не менш, точність вимірювання не залежить безпосередньо від ефективності затримування.
На оцінку ефективності зв'язування впливають багато параметрів, і вони повинні бути оптимізовані для кожного конкретного випадку:
Буфер: Підвищення концентрації солей зменшує ефективність зв'язування. Для більшості комплексів концентрація одновалентних іонів повинна складати близько 150 mM, щоб гарантувати специфічність зв'язуватися.
Температура: Низька температура збільшує ефективність зв'язування.
Швидкість подачі буфера і умови промивки: швидкість подачі буфера повинна бути постійною (однієї і тієї ж) у кожному експерименті. Неспецифічне утримання незв'язаного РНК на фільтрі можна зменшувати інтенсивної промиванням, але найчастіше це веде і до зниження специфічної сорбції в цілому. Тому для деяких комплексів застосовується промивка невеликим об'ємом, у той час як для інших комплексів найкращі результати виходять при промиванні великими обсягами.
Ренатурацією РНК: добре відомо, що різні препарати РНК дають різну ефективність зв'язування. Ретельна ренатурацією зменшує варіабельність між цими препаратами [23].
1.3.1.2. Рухливість в гелі

Оцінка рухливості в гелі заснована на різниці в рухливості між вільними РНК і РНК-білковими комплексами при їх міграції в нативному поліакриламідному гелі. Зростаючий розмір комплексу, а також невеликий позитивний заряд пов'язаних з білками нуклеїнових кислот викликає розходження в їх рухливості.
Метод дозволяє безпосередньо оцінити стехіометрію РНК-білкового комплексу. Якщо зв'язується більш ніж один білок, то видно додаткові зрушення (supershifts) в мобільності РНК. При додавання антитіл, цю особливість можна використовувати для ідентифікації білків в комплексі, коли для утворення комплексу використовуються невідомі препарати білка.
Основна проблема виконання даної методики - це вибір умов, які забезпечують специфічне РНК-білкове зв'язування. Головне при цьому - витримати високу концентрацію солей (300-500 mM NaCI або KC1), але при цьому треба враховувати, що висока концентрація солі тенденцію збільшувати і відсоток дисоціації комплексу при електрофорезі. Таким чином, концентрація солей повинна бути оптимізована в залежності від конкретного експерименту. Багато експерименти з визначення рухливості в гелі РНК-білкових комплексах вивчаються в 50 mM трис-гліцінових буферах, а, наприклад, специфічні комплекси Escherchia coli вимагають принаймні додаткового додавання 150 mM Na та 5 mM Mg .
Якщо комплекс чутливий до підвищення сольової концентрації, неспецифічне зв'язування може бути зменшено додаванням носія РНК [23].
1.3.1.3. Центрифугування в градієнті сахарозний

Центрифугування в градієнті сахарози є найбільш простим, але в той же час менш чутливим методом аналізу РНК-білкових комплексів, основною перевагою якого є значно більші можливості при виборі іонних умов, ніж, наприклад, при використанні електрофоретичних методів. При застосуванні можливо формування спеціальних градієнтів, таких як Ізокінетичний градієнт для визначення коефіцієнтів седиментації.
Найбільш поширеним типом градієнта є лінійний градієнт сахарози. Оскільки рібонуклеопротеіновие комплекси більш щільні в порівнянні з максимально можливою щільністю сахарози (1.3 г / мл), вони завжди утворюють осад у нижній зоні. Так що вибір градієнта для поділу визначається залежністю від кількості обложеної частини: 5-20% (w / w) градієнт зазвичай вибирається для поділу малих нуклеопротеїнів, 10-30% (w / w) градієнт - для поділу сплайсосом, рибосомних субодиниць і монос, оскільки 20-47% (w / w) градієнт - для об'єктів полісомних розмірів [23].

1.3.2. Фізичні методи


Засновані на вирішенні просторових структур РНК-білкових комплексів з атомарним дозволом. До цих методів відносять метод ядерного магнітного резонансу (ЯМР) і метод рентгеноструктурного аналізу.
Метод ЯМР дозволяє бачити структуру макромолекули в розчині без обмежень на взаємне розташування атомів, що накладаються кристалічної упаковкою. В даний час з-за складності і величини РНК-білкових комплексів сфера його застосування сильно обмежена.
Найбільш ефективним і універсальним методом визначення тривимірної структури РНК-білкових комплексів з атомною роздільною здатністю є рентгеноструктурний аналіз. Метод заснований на властивості біологічних макромолекул утворювати монокристали, що представляють собою безліч ідентичних молекул, упорядкованих певним чином. З кристалів можливе отримання рентгенівської дифракційної картини, з подальшим аналізом отриманих даних і побудові на їх основі карти електронної щільності. Потім отримують просторову модель структури, яка після низки уточнень мінімізується по хімічній і кінетичної енергій [5].
Поряд з методом ядерного магнітного резонансу, рентгеноструктурний аналіз також не позбавлений своїх недоліків, найбільш значущими з яких є проблема кристалізації РНК-білкових комплексів (необхідна наявність досить великих, стабільних і однорідних кристалів), а так само фазова проблема, що вирішується методами ізоморфного заміщення, молекулярного заміщення і аномальної дисперсії на декількох довжинах хвиль.
В останні роки, завдяки використанню синхротронного випромінювання, нових типів детекторів, а також розробці нових програм для обробки даних і розрахунку фаз, метод рентгеноструктурного аналізу отримав найбільш широке поширення.
 

2. Експериментальна частина


2.1. Матеріали та методи дослідження


2.1.1. Метод молекулярного заміщення


Для вирішення проблеми фаз у цій роботі використовувався метод молекулярного заміщення. Метод заснований на використанні відомої структури гомологічною молекули (білка, РНК або ДНК) в якості моделі для отримання початкового наближення набору фаз [16].
Для розрахунку початкового набору фаз необхідно, щоб модель найкращим чином аппроксимирована положення невідомою молекули в елементарній комірці кристала. Визначення таких положень моделі є основним завданням методу молекулярного заміщення, яка зазвичай вирішується в два етапи. На першому етапі визначається ортогональноє перетворення W, що забезпечує правильну орієнтацію моделі в кристалічній комірці. На другому етапі проводиться пошук вектора трансляції v, що задає положення орієнтованої моделі в елементарній комірці кристала. Частіше за все, вищезгадана ортогональноє перетворення виражається через кути Ейлера або сферичні кути [37].
2.1.1.1. Функції обертання

Перетворення W можна знайти шляхом порівняння функцій Паттерсона кристала невідомою молекули P x і моделі P m. Критерієм відповідності орієнтації моделі і невідомої молекули служить так звана функція обертання, яка представляє собою інтеграл перекривання функцій P x (r) і P m (W r) в елементі об'єму U і має максимуми якщо системи внутрішніх векторів моделі і невідомої молекули орієнтовані однаково. Існують методи розрахунку функції обертання як у прямому [22], так і в зворотному просторі [37]. У випадку прямого простору функції Паттерсона P x і P m розраховуються в явному вигляді при заданому дозволі за допомогою перетворення Фур'є. Потім відбувається обертання P m щодо P x із заданим кроком і шукаються максимуми функції обертання:
, (1)
де область інтегрування U - як правило сферичний шар з центром у початку координат, поставити мінімальним і максимальним радіусами r min і r max, відповідно. Радіус r min вибирається таким чином, щоб виключити пік функції Паттерсона на початку координат (зазвичай r min ³ 2Е), який може породжувати помилки при чисельному інтегруванні. Радіус r max вибирається так, щоб включити в область інтегрування максимальну кількість внутрішньомолекулярних векторів при мінімально-можливій кількості міжмолекулярних [5].
Для зменшення розрахункових витрат при чисельному інтегруванні на сітці використовуються тільки ті точки, в яких функція P m приймає найбільші значення, а значення функції P x в цих точках розраховуються за допомогою процедури інтерполяції [22].
Застосовуючи перетворення Фур'є і теорему Парсеваля для рівняння (1) можна отримати вираз для функції обертання в зворотному просторі [37]:
, (2)
де h = (h, k, l) позначає міллеровський індекси, а W T - транспоновану матрицю оператора W. Дія W T на | F m (h) | 2 буде в загальному випадку приводити до виникнення точок у зворотному просторі, які не описуються цілочисельними індексами (h, k, l). Значення | F m (h) | 2 в таких точках можуть бути отримані за допомогою так званої інтерференційної функції G [2]:
(3)
Аналіз максимумів R (W) дозволяє не тільки виявити найбільш ймовірні орієнтації моделі в комірці кристала невідомою молекули, але і, у разі декількох молекул в незалежній частини елементарної комірки, знайти операції точкової некрісталлографіческой симетрії, що зв'язують орієнтації цих молекул.
2.1.1.2. Функції трансляції

Другим етапом рішення задачі молекулярного заміщення є визначення положення орієнтованої молекули в комірці кристала. Критерієм відповідності положення моделі і невідомої молекули служить функція трансляції. Існує багато варіантів визначення функції трансляції, в яких використовуються як функції Паттерсона [3, 36], так і коефіцієнти кореляції між експериментальними і розрахунковими амплітудами структурного фактора [20]. Функція трансляції може також включати фазову інформацію [4] і обмеження на можливу кристалічну упаковку молекул [22]. Основною метою при цьому є знаходження глобальних максимумів функції трансляції в залежності від вектора трансляції v, що описує положення моделі в елементарній комірці. Ця задача звичайно вирішується за допомогою процедури пошуку на сітці розбитою по компонентах вектора v.
Функція трансляції, в якій використовується перекривання між експериментальної і розрахованою за моделлю функціями Паттерсона має загальний вигляд:
, (4)
де S j позначає оператори симетрії даної групи [15].
Наявність експериментальної фазової інформації може істотно підвищити відношення сигнал-шум в піках функції трансляції, навіть якщо експериментальний набір фаз містить значні помилки (наприклад, у тих випадках, коли є тільки одна ізоморфна похідна). У формулюванні Ріда і Шірбека [35] функція трансляції, що включає фазову інформацію, визначається таким чином:
, (5)
де ρ x і ρ m - функції експериментальної та модельної електронної щільності, відповідно.
Крім правильної орієнтації моделі, до основних факторів впливає на точність рішення функції трансляції ставляться якість і повнота моделі та рентгеноструктурних даних, діапазон дозволів, а також критерій відбору відповідно до якого ті чи інші структурні амплітуди включаються до розрахунку. Також як і для функції обертання, виняток слабких рефлексів з експериментального набору даних (без помітної шкоди для повноти набору) може дещо знизити рівень шуму функції трансляції [7].
Після того як рішення функції трансляції отримані їх уточнюють за допомогою процедури оптимізації орієнтації і положення моделі як твердого тіла за методом спряжених градієнтів (наприклад, процедура FIT в AmoRe [11] або RIGID _ BODY в CNS [6]).
2.1.1.3. Методи 6-мірного пошуку

При використанні моделей поганої якості (наприклад, у випадку низької гомології) або моделей описують лише малу частину невідомої структури часто виникає ряд проблем, що ускладнюють вирішення завдання молекулярного заміщення звичайними методами. Значні помилки функції обертання, неминуче виникають у таких випадках, посилюють власні помилки функції трансляції і призводять або до повної відсутності правильних рішень, або до того, що ці рішення виявляються серед максимумів, що лежать на рівні шуму і немає достовірних критеріїв дозволяють однозначно виділити їх серед інших .
Єдиним на сьогоднішній день загальним підходом, що дозволяє вирішувати перераховані вище проблеми, і до певної міри розширити межі застосування методу молекулярного заміщення, є відмова від поділу завдання на пошук рішень функцій обертання і трансляції та застосування процедури 6-мірного пошуку з одночасним варіюванням як кутів Ейлера (α, β, γ), так і компонент вектора трансляції (v x, v y, v z). Але, незважаючи на значний прогрес обчислювальної техніки, ні в жодній з існуючих програм, включаючи найсучасніші, 6-мірний пошук не проводиться безпосередньо, як систематичний пошук на 6-мірної сітці. Таким чином, жодна з існуючих програм не гарантує знаходження абсолютних максимумів об'єднаної функції обертання-трансляції.
Не так давно, двома групами незалежно були запропоновані стохастичні алгоритми 6-мірного пошуку, які дозволили створити програми, які стали стандартним інструментом у рентгенівської кристалографії макромолекул:
1) У роботі Кіссінджера та ін [26] був застосований так званий еволюційний алгоритм, який належить до сімейства алгоритмів стохастичної оптимізації, що включає такі методи як Монте-Карло [28] і повільний відпал [25].
2) Генетичний алгоритм, незалежно запропонований Чангом і Льюїсом [14], заснований на тому ж самому принципі, що і еволюційний і відрізняється від останнього лише деякими деталями реалізації. Подібний підхід застосовувався також для розробки процедури пошуку положень важких атомів в тяжелоатомних похідних кристалів макромолекул [13] і в прямих методах розрахунку фаз для кристалів вірусних частинок [29].
Еволюційний алгоритм використовує принцип природного відбору для знаходження оптимальних рішень. Спочатку генерується набір випадкових рішень, що задають одночасно і орієнтацію і положення моделі в елементарній комірці. Потім розраховуються структурні чинники F m для кожного рішення і проводиться відбір кращих рішень виходячи з коефіцієнта лінійної кореляції [26].
Відібрані рішення зберігаються і використовуються для створення нового набору з тією ж кількістю елементів, що і в попередньому. Відсутні елементи нового набору отримують, вносячи в орієнтації і положення відібраних рішень випадкові зміни відповідно з нормальним розподілом. Таким чином, щільність розподілу елементів нового набору вже не буде рівномірною, а буде мати максимуми в околицях відібраних рішень. Потім знову відбувається розрахунок структурних чинників F m, відбір кращих рішень, створення наступного набору, і так далі, поки не буде отримано рішення з деяким оптимальним значенням коефіцієнта лінійної кореляції. На останній стадії, для кращого відібраного рішення проводиться оптимізація орієнтації і положення моделі як твердого тіла за методом спряжених градієнтів [33].
Швидкість 6-мірного пошуку з використанням еволюційного алгоритму значно збільшується за рахунок застосування методу безперервних перетворень структурних факторів [14, 26]. У цьому методі структурні чинники розраховуються один раз за допомогою швидкого перетворення Фур'є (FFT) для моделі, вміщеній в початок координат штучної осередку симетрії P 1. В ході 6-мірного пошуку, зміна орієнтації моделі враховується шляхом ортогональних перетворень індексів оберненої гратки та використання лінійної інтерполяції в оберненому просторі. Зміна положення моделі враховується застосуванням відповідних фазових зрушень. При цьому, беруться до уваги вклади всіх симетрично пов'язаних молекул.
Однією з серйозних проблем, що виникають при уточненні фаз, отриманих методом молекулярного заміщення, є так звана "model-bias" проблема [34]. Ця проблема виявляється в тому, що якщо частина моделі не відповідає реальній структурі, то на карті електронної щільності, розрахованої за моделлю, дана ділянка буде більшою мірою відповідати моделі ніж реальної структури. Традиційно, ця проблема вирішується за допомогою OMIT карт електронної щільності, розрахованих за моделлю, з якої виключений цікавить ділянку. З введенням Брюнгером в програму CNS [6] можливості модифікації електронної щільності розрахованої за моделлю, з'явився ще один спосіб вирішення цієї проблеми.
Таким чином, метод молекулярного заміщення являє собою потужний інструмент в кристалографії макромолекул, який у разі високої гомології дозволяє швидко і ефективно вирішувати фазову проблему. У міру того як кількість відомих структур макромолекул неухильно зростає, метод молекулярного заміщення стає все більш і більш актуальним.

2.1.2. Збір та обробка дифракційних даних


Збір дифракційних даних комплексу S15-16SрРНК (S15 T3C мутант) проводився на синхротроні ESRF (Гренобль, Франція), лінія ID14 З використанням детектора Mar CCD (l = 0.93300 Е; Т = 100К).
Отримані дані обробляли програмами DENZO і SCALEPACK. Обробка даних має ряд етапів:
1) Виділення сильних рефлексів;
2) Передбачення оберненої гратки;
3) Визначення просторової групи і параметрів комірки;
4) Уточнення параметрів кристала і детектора;
5) Обробка всіх наявних зображень;
6) Приведення рефлексів до загальної шкалою;
7) Інтегрування рефлексів по всьому зворотному простору.
У результаті ми отримали набір дифракційних даних у зворотному просторі.

2.1.3. Рішення проблеми фаз


Початковий набір фаз отриманий за допомогою методу молекулярного заміщення. Основою для моделі послужила структура з заміною Met на SeMet комплексу S15 (I11M + A79M)-16SрРНК.
Для вирішення завдання молекулярного заміщення використовувалася процедура оптимізації орієнтації і положення моделі як твердого тіла за методом спряжених градієнтів. Розрахунки проводилися за допомогою програми комплексу CNS RIGIT - BODY REFINEMENT. Отриманий R-фактор (0,339), показав, що при загальній гомології комплексів (»99%) все ж спостерігається розбіжність у бічних ланцюгах і петлях.

2.1.4. Побудова та уточнення моделі


Спочатку було проведено кілька циклів автоматичного (програмою CNS) кристалографічного уточнення, яке включало в себе молекулярно-динамічну процедуру модельованого відпалу (ANNELING), що проводиться у внутрішніх координатах; вказаними параметрами були торсіонні кути. При цьому використовувалися обмеження (типу "restraints") відповідно до операцією некрісталлографіческой симетрії.
Потім були отримані дві карти електронної щільності:
1) карта, розрахована з використанням коефіцієнтів 2fo-fc, де fo - структурний фактор, отриманий експериментально на основі дифракційних даних, fc - структурний фактор, розрахований на основі моделі
2) composit - omit map - різницева 2fo-fc карта, де fc визначається як комбінована величина, розрахована по декількох моделях з виключенням 5% атомів на кожному кроці.
Отримані карти були хорошої якості, що дозволило вписати всі бічні залишки білка, уточнити положення головного ланцюга і молекули РНК. Для ручної правки використовувалася програма молекулярної графіки О.
Остаточне уточнення включало уточнення параметрів довжин зв'язків і кутів за допомогою програми MINIMIZE (CNS), уточнення По-факторів для індивідуальних атомів, а так само перевірку стереохімії отриманої структури і відстаней між атомами (водневі зв'язки, Ван-дер-вальсовий взаємодії, «погані» відстані).
Остаточна модель, уточнена до значень R-фактора *** 8% і R free ***% при вирішенні до 2,8 Е, включає ** амінокислотних залишків і ** нуклеотидів. Крім того були локалізовані *** молекул води, ** іонів іонів Mg +2 в незалежній частини елементарної комірки. Загальне число атомів моделі в незалежній частини елементарної комірки склало ****. Модель володіє хорошими стехіометричним параметрами і не містить залишків, розташованих у заборонених областях карти Рамачандрана. Частина остаточної 2F o-F c карти електронної густини на рівні 1.5 s показана на рис. 20. Структура комплексу S15-16SрРНК схематично показана на рис. 21. Координати атомів остаточної моделі комплексу S15-16SрРНК занесені в RCSB Protein Data Bank (код ****).

2.2. Результати та їх обговорення


У результаті проведеної роботи була побудована модель структури комплексу S15-16SрРНК (S15 T3C мутант).
Модель була уточнена до R-фактора 24,5% і R free 30,9% при вирішенні до 2,9 Е, і включає 86 амінокислотних залишків і 57 нуклеотидів. Загальне число атомів моделі в незалежній частини елементарної комірки склало 1943. Модель володіє хорошими стехіометричним параметрами і не містить залишків, розташованих у заборонених областях карти Рамачандрана.
Таблиця 2.2.1. Статистика уточнення структури комплексу комплексу S15-16SрРНК (S15 T3C мутант)
Просторова група
Р6422
Параметри комірки (Е)
a = 128.228, b = 128.2286, c = 64.9505
Довжина хвилі (Е)
0,933
Дозвіл (Е)
500 - 2,9
Надмірність
5,9
Повнота набору (%)
98,0
Rsym (%)
3,1
Rcryst / Rfree (%)
24,5 / 30,9
Дозвіл (Е)
6,0 - 2,9
Число рефлексів
8209
ВСР (Е )
44,8
Rmsd зв'язків (Е)
0,006
Rmsd кутів (°)
1,2

Як видно з малюнка 2.2.1., Білок S15 відноситься до сімейства a-спіральних білків і складається з чотирьох a-спіралей, взаємодіючих з 16SрРНК і стабілізуючих дану структуру.
Фрагмент 16S рРНК з T. Thermophilus (рис. 2.2.2.) Довжиною 57 нт складається з укорочених спіралей Н20, Н21 і Н22. Спіраль Н22 стикується зі спіраллю Н21, утворюючи витягнуту структуру, а спіраль Н20 прилягає до неї під кутом приблизно в 60 °.
ріс.2.2.1. Структура білка S15 (T3C мутант)
рис. 2.2.2. Структура фрагменту 16S рРНК
Білок S15 розпізнає на поверхні РНК два віддалених ділянки, один з яких розташовується у верхній частині спіралі H22, а інший - в районі з'єднання трьох спіралей РНК (рис. 2.2.3.). Ділянки відстають один від одного на один виток спіралі.
ріс.2.2.3. Структура комплексу S15-16SрРНК (S15 T3C мутант)

Висновки:


1. Отримано та опрацьовано набір дифракційних даних для комплексу S15-16SрРНК (S15 T3C мутант).
2. Методом молекулярного заміщення визначена структура комплексу.
3. Показано, що рибосомних білок комплексу S15 зв'язується з 16S рРНК у двох просторово віддалених ділянках.
4. Показано, що мутація Т3С не змінює просторової структури комплексу і структури РНК-білкового інтерфейсу.

Список літератури:


1. Серганов А.А. (1997) Вивчення РНК-зв'язуючих властивостей рибосомного білка S15 з Thermus thermophilus. Дисертація, МДУ.
2. Anston AA, Otridge J., Brzozowski AM, Dodson EJ, Dodson GG, Wilson KS, Smith TM, Yang M., Kurecki T., Gollnick P. (1995). Biochemestry. 18: 693-700
3. Argos P. & Rossmann MG (1980) in "Theory and Practice of Direct Methods in Crystallography" (Ladd and Palmer, eds.), Pp.361-417. Plenum, New York.
4. Bentley GA & Houndusse A. (1992), Acta Cryst. A48, 312-322.
5. Blundell TL & Johnson LN (1974) Protein Crystallography. Academic Press, New York.
6. Brunger AT, Adams PD, Clore GM, DeLano WL, Gros P., Grosse-Kunstleve RW, Jiang J., Kuszewski J., Nilges M., Pannu NS, Read RJ, Rice LM, Simonson T., Warren GL (1998 ) Crystallography & NMR System: A New Software Suite for Macromolecular Structure Determination. Acta Cryst. D54, 909-921.
7. Brunger AT, Milburn MV, Tong L., de Vos AM, Jancarik J., Yamazumi Z., Nishimura S., Ohtsuka E., Kim S.-H. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4849-4853.
8. Burd CG Dreifuss G. (1994). Conserved structures and diversity of functions of RNA-binding proteins. Science 265: 615-620
9. Bycroft M., Grunert S., Murzin A., Proctor M., Johnston D. (1995). NMR solution structure of a dsRNA binding domain from Drosophila staufen protein reveals homology to the N-terminal domain of ribosomal protein S5. EMBO J. 14: 3563-3571
10. Bycroft M., Hubbard TJP, Proctor M., Freund SMV, Murzin A. (1997). The solution structure of the S1 RNA binding domain: a member of an ancient nucleic acid-binding fold. Cell 88: 235-242
11. Castellano E., Oliva G., Navaza J. (1992), J. Appl. Cryst. 25, 281.
12. Cate JH, Gooding AR, Podell E., Zhou K., Golden BL, Szewczak AA, Kundrot CE, CechT.R., Doudna JA (1996). RNA tertiary structure mediation by adenosine platforms. Science 273: 1696-1699
13. Chang G. & Lewis M. (1994), Acta Cryst. D50, 667-674.
14. Chang G. & Lewis M. (1997) Molecular Replacement Using Genetic Algorithms. Acta Cryst. D53, 279-289.
15. Crowther RA & Blow DM (1967), Acta Cryst. 23, 544-548.
16. Crowther RA (1972) in "The Molecular Replacement Method", Int. Sci. Rev. No.13 (Rossmann MG, ed.). Gordon & Breach, New York.
17. Draper DE (1995). Protein-RNA recognition. Annu. Rev. Biochem. 64: 593-620
18. Draper DE (1996) Ribosomal protein-RNA interactions. In Ribosomal RNA: structure, evolution, processing and function in protein biosynthesis. Eds. Zimmermann RA, Dahlberg AE Boca Raton, Florida, CRC Press, 171-198
19. Franklin C., Shi JP, Shimmel P. (1992). Overlapping nucleotide determinante for specific aminocylation of RNA. Science. 225: 1121-1125
20. Fujinaga M. & Read RJ (1987), J. Appl. Cryst. 20, 517-521.
21. Harada Y., Lifchitz A., Berthou J., Jolles P. (1981), Acta Cryst. A37, 398-406.
22. Huber R. (1965), Acta Cryst. A19, 353-356.
23. Kjems J., Egebjerg J., Christiansen J. (1998) Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Elsevier, 237
24. Kim JL, Nikolov DB, Burley SK (1993). Co-crystal structure of TBP recognizing the minor groove of a TATA element. Nature 365: 520-527
25. Kirkpatrick S., Gelatt CD Jr & Vecchi MP (1983), Science, 220, 671-680.
26. Kissinger CR, Gehlhaar DK, Fogel DB (1999) Rapid automated molecular replacement by evolutionary search. Acta Cryst. D55, 484-491.
27. Marino JP, Gregorian RS, Csankovski G., Grothers DM (1995). Ent helix formation between RNA hairpins with complementary loops. Science 268: 1448-1254
28. Metropolis N., Rosenbluth AW, Rosenbluth MN, Teller A. & Teller E. (1953), J. Chem. Phys. 21, 1087-1092.
29. Miller ST, Hogle JM & Filman DJ (1996), Acta Cryst. D52, 235-251.
30. Musco G., stier G., Joseph C., Morelli MAC, Nilges M., Gibson TJ, Pastore A.. (1996) Thre-dimensional structure and stability of the KH domain: molecular insight into the fragile X syndrome. Cell 85: 237-245
31. Nevskaya, N., Tishchenko, S., Nikulin, A., Al-Karadaghi, S., Liljas, A., Ehresmann, B., Ehresmann, C., Garber, M., Nikonov, S. (1998) Crystal Structure of Ribosomal Protein S8 from Thermus Thermophilus Reveals a High Degree of Structural Conservation of a Specific RNA Binding Site. J.Mol.Biol. 279, 233-244.
32. Normanly J., Abelson J. (1989). TRNA identity. Annu. Rev. Biochem. 58: 1029-1049
33. Powell MJD (1977), Math. Programming, 12, 241-254.
34. Read RJ (1997) Model Phases: Probabilities and Bias. In Methods in Enzymology, 277, 110-128, Academic Press.
35. Read RJ & Schierbeek AJ (1988), J. Appl. Cryst. 21, 490-495.
36. Rossmann MG, Blow DM, Harding MM, Coller E. (1964), Acta Cryst. 17, 338-342.
37. Rossmann MG & Blow DM (1962), Acta Cryst. 15, 24-31
38. Schindelin H., Marahiel MA, Heinemann U. (1993). Universal nucleic acid-binding domain revealed by crystal structure og the B.subtilis major cold-shock domain. Nature 364: 164-168
39. & N
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Курсова
85.8кб. | скачати


Схожі роботи:
Мода на комп`ютерний аналіз
Комп`ютерний жаргон
Комп`ютерний сленг
Сучасний комп`ютерний жаргон
Комп`ютерний клуб Chicago 2
Комп`ютерний клуб Chicago
Нейро-комп`ютерний інтерфейс
Комп`ютерний облік переваги та недоліки
Комп`ютерний морфологічний розбір слів російської мови
© Усі права захищені
написати до нас
Рейтинг@Mail.ru