Біогенез мембран

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.


Нажми чтобы узнать.
скачати

Біогенез мембран

Введення

Розглянемо процес утворення мембран. Цей процес починається з синтезу білкових і ліпідних компонентів, які потім повинні бути доставлені до місця призначення. Беручи до уваги все розмаїття мембран, існуючих в типовій еукаріотичної клітці, можна зробити висновок, що для здійснення цього процесу необхідні надзвичайно точні механізми.

Обговоримо питання біогенезу мембранних білків. У принципі є дві головні проблеми, що стосуються складання мембранних білків.

  1. Всі закодовані в ядрі білки синтезуються загальним пулом рибосом. У зв'язку з цим виникає питання: як окремі мембранні білки доставляються до місця призначення? Чим відрізняються білки плазматичної мембрани від білків внутрішньої мітохон-дріальной мембрани або від білків мембран ендоплазматичного ретикулума? Цю складну проблему сортування можна вирішити тільки за наявності певних сигнальних послідовностей в кожному поліпептиди, а також відповідного апарату впізнавання.

  2. Який справжній механізм вбудовування мембранних білків у мембрану і як при цьому досягається правильна їх орієнтація щодо мембранного бішару? Чи потребують механізми вбудовування і орієнтації також наявності певних сигнальних елементів і систем впізнавання і якщо так, то які вони? Які властивості забезпечують при вбудовуванні мембранних білків формування правильної третинної, а також четвертинні структури у разі мультісуб'едііічних ансамблів?

За останнє десятиліття в пошуку відповідей на всі ці питання досягнуті великі успіхи, причому вони стають все більш значними. Це великою мірою зумовлено тим, що для з'ясування ролі специфічних сигнальних поліпептидних послідовностей в цих процесах стала використовуватися рекомбінантна ДНК. Хоча не на всі питання вдалося знайти відповіді, отримані результати все більше переконують в тому, що абсолютно різні на перший погляд системи справді мають фундаментальним схожістю. Наприклад, не так давно було показано, що механізм секреції білків має багато спільного з механізмом синтезу білків плазматичної мембрани. Зовсім недавно досягнутий великий прогрес у розумінні загальних принципів перенесення білків через мембрани мітохондрій, ендоплазматичного ретикуло-ма і грамнегативних бактерій. Ці експериментальні системи вивчалися найбільш інтенсивно. І хоча між відповідними процесами є значні відмінності, вони мають ряд загальних особливостей.

  1. Існує ідентифікується частина поліпептидного послідовності, яка служить ділянкою впізнавання, або «сигналом», що направляють окремий поліпептид до мембрани, в яку він вбудовується. -конце новосинтезированного полипептида и отщепляются специфическими сигнальными пептидазами после встраивания его в нужную мембрану или переноса через нее. Ці сигнальні ділянки часто розташовані на N-кінці новосинтезованих поліпептиду і відщеплюються специфічними сигнальними пептідаза після вбудовування його в потрібну мембрану або перенесення через неї. -концевого сигнала различными авторами использовались следующие термины: сигнальный пептид, сигнальная последовательность, транзитный пептид, лидирующий пептид, пре-последовательность. Для позначення N-кінцевого сигналу різними авторами використовувалися такі терміни: сигнальний пептид, сигнальна послідовність, транзитний пептид, лідируючий пептид, пре-послідовність.

  2. Процеси трансляції і вбудовування білків у мембрану можна розділити в експерименті. Для складання мембранних білків у більшості випадків необхідна енергія, яка відрізняється за розміром від тієї, яка потрібна для їх трансляції на рибосомі. Помічено, що in трансляция и перенос часто бывают тесно сопряжены во времени. vivo трансляція і перенесення часто бувають тісно поєднані в часі.

  3. Зв'язавшись з мембраною-мішенню поліпептид повинен, крім того, перебувати в конформації, в якій може здійснюватися його перенесення через мембрану або вбудовування в неї. -конца к С-концу, при этом необходимо, чтобы белок был по крайней мере частично развернут или слабо свернут. У багатьох випадках перенесення білків через мембрани відбувається від N-кінця до С-кінця, при цьому необхідно, щоб білок був принаймні частково розгорнуто або слабо згорнутий. Поліпептид може транспонуватися у витягнутій формі в ході енергозалежної процесу.

Перша група питань, які ми розглянемо, пов'язана з сортуванням білків під час біогенезу і збірки. На рис. 10.1 представлена ​​схема., Що ілюструє всю складність цієї проблеми та підсумовуються дані по еукаріотичних клітин і грамот від'ємних бактерій. Доставка кожного білка до місця призначення забезпечується ієрархією сигналів, закодованих в кожному поліпептиди. -конце у них имеется дополнительная последователь- Наприклад, більшість білків, призначених для ендоплазматичного ретикулума або мітохондрій, синтезується у вигляді попередників більшою молекулярної маси; на N-кінці у них є додаткова послідовник-

ність, яка відщеплюється особливими протеолітичними ферментами, які є в цих органелах. Такі первинні сигнали дуже різні і необхідні для того, щоб поліпептиди були узіани при транслокації специфічними рецепторами в цих органелах. Зв'язування з мітохондріями відбувається відразу після завершення трансляції. Однак для більшості білків, які направляються в ендоплазматичний ретикулум в клітинах ссавців, спостерігається інша картина. Як видно з рис. 10.1, після зв'язування білків з відповідною органели повинна відбутися подальша сортування. Для цього потрібна додаткова інформація, яка також повинна бути закодована в кожній поліпептидного послідовності і може розглядатися як вторинні сигнали. У кількох випадках їх вдалося ідентифікувати як сигнальні послідовності, фізично відокремлені від первинних, хоча, можливо, так буває не завжди. Пізніше ми розглянемо характерні приклади використання цих сигналів при сортуванні білків.

Особливий інтерес для нас представляє процес складання мембранних білків, який доцільно розглянути в зв'язку з їх сортуванням. На рис. 2 схематично показані три загальних механізму проникнення пептидного попередника в мембрану. Механізми А до Б, є варіантами схеми лінійного витіснення, згідно з якою сигнальна послідовність направляє поліпептид до переносящему пристрою, який включає в себе заповнений водою канал. Сигнальна послідовність може проходити прямо крізь канал або залишатися пов'язаної з мембраною, утворюючи, як показано на рис. 10.2, петлю. У відсутність будь-якого сигналу зупинки процесу перенесення поліпептид буде транспортуватися через мембрану цілком. Однак, якщо всередині поліпептиду є другий сигнальний пептид, званий стогмігналом перенесення, то процес зупиняється і стоп-сигнал перенесення стає трансмембранним сегментом зрілого мембранного білка. Фіксуючи білок в мембрані, стоп-сигнал перенесення діє як сигнал сортування. Якщо в білку є й інші сигнали початку і кінця перенесення, то будуть утворюватися такі трансмембранні сегменти. Рис. 10.3 показує, як поєднання декількох видів сигналів може направляти послідовність реакцій таким чином, щоб створювалося широке розмаїття типів упаковки вбудовуються в мембрану білків ендоплазматичного ретикулуму. - или С-конце. Зауважимо, що сигнальні послідовності, які не видаляються протеолітіче-ським шляхом, залишаються на початку трансмембранних сегментів і можуть використовуватися для ініціації транспорту фланкують полнпептідних доменів на N - або С-кінці. На жаль, ця проста схема не є вичерпною, відомі приклади, коли сигнали змінюють свою функцію в залежності від обставин або коли в правильному включенні в мембрану істотну роль грають взаємодії між передбачуваними сигналами всередині поліпептиду.

Схема В на рис. 10.2 ілюструє можливу роль мимовільного включення в мембрану гідрофобних елементів поліпептидного попередника. Цей механізм може реалізовуватися тільки тоді, коли включення в мембрану відбувається після трансляції поліпептиду. Першим прикладом, що підтверджує існування цього механізму, є пробелок оболонки фага М13. Модель мимовільного включення може використовуватися для пояснення механізму вбудовування поперек мембрани амфіфільних а-спіралей або 0-структур. Цей процес може також, звичайно, бути белокзавісімим.

Про координацію біосинтезу мембранних ліпідів і білків у про карнотітескіх або еукаріотичних клітинах відомо небагато. Встановлено, втім, що в кількох випадках сверхпродукція окремих мембранних білків призводить до розростання внутрішньоклітинних мембран, що містять ліпіди і в переважній кількості - сверхпродуцірованний білок. Та обставина, що піпідний складу різноманітних мембран в еука-ріотіческой клітці істотно різниться, дозволяє задатися питанням, як ці композиції ліпідів створюються і підтримуються. Ми зупинимося, зокрема, на швидкості обміну різних видів ліпідів між мембранами і можливі механізми, обліг чающих перенесення ліпідів від місця їх синтезу до місця призначення. Нарешті, відомо, що ліпідний склад мембран численних організмів варіює при зміні зовнішніх умов.


2. Загальні особливості екзоцітозного шляху

Екзоцітозним в еукаріотичних клітинах називається шлях, за допомогою якого здійснюється транспорт білків, секретується кліткою або включаються в зовнішню мембрану. Секретуються білки синтезуються на пов'язаних з мембранами рибосомах на ци-топлазматіческой поверхні шорсткого ендоплазматичного ретикулума і виводяться з клітини за допомогою того ж механізму, який використовується для включення мембранних білків в ендо-плазматичний ретикулум. Якщо водорозчинний білок не має вторинних сигналів сортування, то він транспортується до клітинної поверхні і секретується з допомогою «конститутивного» шляху. Цей шлях екзоцитозу вивчався з залученням різних цитохімічних методів, генетичних підходів і біохімічних досліджень безклітинних систем. Білки, що транспортуються цим шляхом, переміщуються з ендоплазматичного ретикулуму послідовно через різні компартменти комплексу Гольджі і врешті-решт потрапляють на поверхню клітини. Вони можуть ставати компонентами цітоплазматіче-ської мембрани або, при наявності вторинних сигналів сортування, залишатися в еідоплазматіческом ретикулуме або в комплексі Гольджі. У комплексі Гольджі в ході подальшої сортування відокремлюються білки, секретуються конститутивним шляхом, від тих, які направляються в лізосоми або концентруються в секреторних гранулах, за допомогою яких вони потім секретуються при відповідній стимуляції клітини. Крім того, виявлено, що в зовнішній мембрані ядерної оболонки також можуть синтезуватися мембранні глнкопротеіни, які потім транспортуються за допомогою екзоцитозу.

Білки при транспортуванні по екзоцітозному шляху піддаються посттрансляційним модифікаціям, зокрема глікозилюються-ня. -связанного олигосахарида, что очень помогло определению различных компонентов комплекса Гольджи. Добре вивчена компартментація процесингу N-зв'язаного олігосахариду, що дуже допомогло визначенню різних компонентів комплексу Гольджі. Олігосахаридних попередник з високим вмістом манози приєднується по місцях глікозилювання в поліпептиди, коли білок знаходиться всередині ендоплазматичного ретикулума, а потім за допомогою декількох розташованих в різних Компартія-ментів ферментів здійснюється процес дозрівання. Це дозволяє стежити за перетворенням білків, визначаючи стан їх глікозірованія. На рис. 10.5 представлений

процесинг олітосахарідного попередника з високим вмістом манози.

У дослідженнях екзоцітозного шляху був досягнутий значний прогрес завдяки використанню вірусів з оболонкою, зокрема вірусу везикулярного стоматиту. -бел-ком, — это трансмембраниый белок, который синтезируется на рибосомах, связанных с эндоплазматическим ретикулумом, после инфекции. Глікопротеїн шилоподібний структури вірусу везикулярного стоматиту, званий G-біл-ком, - це трансмембраніий білок, який синтезується на рибосомах, пов'язаних з ендоплазматичним ретикулумом, після інфекції. -белок попадает на плазматическую мембрану, где он участвует в образовании отпочковывающегося вируса. За допомогою екзоцітозного шляху G-білок потрапляє на плазматичну мембрану, де він бере участь в утворенні відбруньковуються вірусу. -белка, что позволит исследовать экзоцитозный путь. Інфікуючи клітини цим вірусом, можна простежити за процесингом кодованого вірусним геномом G-білка, що дозволить дослідити екзоцітозний шлях. Цей підхід використовується для ідентифікації везикул, що беруть участь у внутрішньоклітинному транспорті, для вивчення-

чення впливу глікозірованія на доставку білків до клітинної поверхні, для дослідження енергетики екзоцітозного транспорту і, що найбільш важливо, для створення безклітинних системи везикулярного внутрішньоклітинного транспорту.

Ці дослідження виявили кілька чудових особливостей системи екзоцітозного транспорту.

1. Транспорт між різними компартментах органели здійснюється за допомогою везикул, які відокремлюються від «донорной» мембрани і потім зливаються з «акцепторної». Показано, що везикули, які беруть участь у транспорті між компартментах комплексу Гольджі, є «облямованими», але відповідний білок відрізняється від клатріна, обмережує ендоці-тозние везикули. Є вагомі дані на користь того, що клатрін не є суттєвим компонентом екзоцітозного шляху, хоча він, мабуть, необхідний для нормального росту деяких штамів дріжджів. Ступінь спільності ком-

поіентов еідоцітозного і екзоцітозного шляхів неясна, хоча деякі везикули, ймовірно, функціонують в обох випадках.

  1. Для внутрішньоклітинного транспорту необхідний АТР, а також білкові компоненти цитозолю. Показано, що для транспорту між цистернами Гольджі, осуществляющегося за участю везикул, необхідно жирнокислотного похідне ацил-СоА. Яку саме функцію виконують зазначені сполуки в отпочковиваніі і злиття везикул, невідомо.

  2. Роль олігосахариду як сигналу сортування новосінтезіро-ванних глікопротеїнів, мабуть, непостійна. -концевого углевода не является необходимым для экспрессии белка плазматической мембраны на клеточной поверхности. Відомі випадки, коли процесинг N-кінцевого вуглеводу не є необхідним для експресії білка плазматичної мембрани на клітинній поверхні. В інших системах глікозилювання істотно для доставки білка до клітинної поверхні, наприклад, воно необхідне для включення опсина в мембрану зовнішнього сегмента палички сітківки. У багатьох клітинах ссавців сигналом сортування для білків, що направляються в лізосоми, є манози-6-фосфат, однак для дріжджів це не характерно. У тих клітинах ссавців, де манози-фосфат функціонує як сигнал сортування, виявлено два мембранних рецептора з високою спорідненістю до глікопротеїнів, що містить манози-6-фосфат, і клоновані їх гени. Вони відіграють ключову роль у процесі перенесення конкретних поліпептидів в лізосоми, а один з цих рецепторів істотний як для ендоцитозу, так і для екзоцитозу.

Дослідження безклітинних системи, зображеної на рис. 10.6, показало, що для вивчення таких складних систем корисно використовувати специфічні мутанти. Виділено безліч мутантних штамів дріжджів, дефектних за різними стадіями екзоцітозного шляху, і деякі з них використовувалися при створенні безклітинних системи транспорту між органелами. Виявилося, що системи дріжджів і ссавців дуже подібні, і для дослідження останніх можна з успіхом використовувати му-тантние штами дріжджів. Нарешті, виявлено, що багато вірусів з оболонкою здатні відбруньковуватися не тільки від плазматичних, але і від інших мембран і, таким чином, можуть бути корисні для вивчення інших аспектів внутрішньоклітинної сортування білків і мембранного транспорту.

Вивчення внутрішньоклітинного транспорту, здійснюваного за допомогою везикул in vitro

На рис. -белка между соседними компартментами комплекса Гольджи in 6 схематично представлений метод вивчення транспорту вірусного G-білка між сусідніми компартментах комплексу Гольджі in . vitro. Важливою особливістю методу є те, що він дозволяє визначити біохімічним шляхом компоненти, необхідні для цього процесу. З двох типів клітин, що позначаються як «донор» і «акцептор», виділяють мембранні фракції, що містять комплекс Гольджі. - N -ацетилглюкозамингликозилтрансфераза I и которые были инфицированы вирусом везикулярного стоматита. При цьому донорно фракцію отримують з мутантних клітин, у яких відсутній фермент UDP - N-ацетилглюкозамингликозилтрансфераза I і які були інфіковані вірусом везикулярного стоматиту. -белком, в этих клетках блокирован. Процессннг олігосаха-рида, пов'язаного з G-білком, в цих клітинах блокований. Акцепторні фракцію отримують з неінфікованих клітин дикого типу. -белку должен произойти перенос G -белка от донорной фракции к акцепторной, где необходимый фермент имеется. Для приєднання И-ацетилглюкозаміну до новосинтезованих-ному G-білку повинен відбутися перенесення G-білка від донорной фракції до акцепторної, де необхідний фермент є. Кількість включеного И-ацетилглюкозаміну визначають після иммунопреципитации. / uc -компартмента аппарата Гольджи в медиальный компартмент. Дана методика дозволяє досліджувати транспорт з t / uc-компартмента апарату Гольджі в медіальний компартмент. Аналогічні роботи, в яких спостерігали за приєднанням сиаловой кислоти, виявили наявність транспорту in между транс- элементами аппарата Гольджи. vitro між транс-елементами апарату Гольджі.

3. Характерні особливості біосинтезу мембранних білків

Проблема збірки білків дуже важлива. Як ми побачимо, цей процес зазвичай не протікає мимовільно, лише в результаті взаємодії між утворюються поліпептидами і ліпід-ним бішару. Навпаки, він є енергозалежною і опосередковується білковими структурами, які поки не вивчені в достатній мірі. Експериментальні дані свідчать про те, що перенесення білків через мембрану і складання інтегральних мембранних білків - це тісно пов'язані сторони одного і того ж процесу. Логічно чекати, що проблеми транспортування білків через мембрани і їх укладання повинні вирішуватися однаковим чином. Перш ніж обговорювати загальні особливості складання молекул у різних системах, корисно зупинитися на методах експериментального дослідження цього процесу.

Найбільш детально вивчені безклітинні системи, в яких набагато легше кількісно дослідити процеси переносу і про-теолітіческого процесингу білків. У всіх цих системах використовуються мембранні везикули або препарати органел, у яких поверхня, обернена в цитоплазму, «дивиться» назовні, оскільки перенесення білків здійснюється з цитоплазми. Цій умові задовольняють мікросоми, отримані з ендоплазматичного ретикулуму секретирующих клітин, мітохондрій і хлоро-пластів. ; они представляют собой удобный объект для изучения переноса белков в бесклеточной системе. Вивернуті везикули можна отримати з клітин Є. coli; вони представляють собою зручний об'єкт для вивчення перенесення білків в безклітинних системі.

Поліпептид-попередник, що знаходиться у зовнішньому середовищі, при відповідних умовах буде переноситися всередину бульбашки або, принаймні, через мембрану бульбашки або органели. За цим процесом зазвичай стежать, додаючи протеази в зовнішнє середовище. Ступінь захисту від протеолізу є мірою кількості поліпептиду, транспортованого всередину везикули або органели. Як показано схематично на рис. 10.7, за ходом протеоліті-чеського процесингу, здійснюваного сигнальної пептидаз, стежать за допомогою електрофорезу в поліакриламіду гелі в присутності ДСН. Білка, убудований у мембрану, можна ідентифікувати за допомогою лужної екстракції; при цьому передбачається, що білки, які пов'язані з поверхнею мембран, при такій обробці видаляються. Однак так буває не завжди, тому результати, отримані за допомогою лужної екстракції, необхідно інтерпретувати з обережністю.

У таких безклітинних системах можна вивчати біохімічні умови переносу білків та ідентифікувати необхідні розчи-

рімие компоненти. Крім того, при цьому можна варіювати природу стерпного поліпептидного «субстрату». Аналогічні дослідження можна проводити in с помощью метода импульсного мечения. vivo за допомогою методу імпульсного мічення. При цьому зменшується ймовірність появи артефактів, пов'язаних з штучністю безклітинних систем. Переконливі дані на цей рахунок були отримані для процесу перенесення білків в хлоропласт ах і мітохондріях, а також - після тривалих дискусій - для перенесення через бак-

термальну мембрану. Довгий час вважалося, що перенесення білків в ендоплазматичний ретикулум або через мембрани ендоплазматичного ретикулуму завжди здійснюється паралельно трансляції, проте врешті-решт було чітко показано, що така паралельність не обов'язкова. Принаймні в одному випадку - для препро-а-фактора - спостерігався посттрансляційної транспорт у мікросоми дріжджів, що не залежить від рибосом. Було також показано, що хоча у вищих еукаріот для переносу через ендоплазматичний ретикулум елонгації білків не потрібно, в більшості випадків процес переносу все-таки залежить від рибосом і відбувається в той час, коли новосінтезіро-ний поліпептид ще утримується рибосомою, Важливий висновок полягає в тому, що енергія, необхідна для перенесення, не походить від рибосомного биосинтетического апарату.

Зауважимо, що ці дані лише констатують те, що процеси переносу і трансляції можна розмежувати експериментально. . У клітці ці процеси тісно пов'язані, принаймні, у випадку білків, що транспортуються в ендоплазматичний ретикулум клітин ссавців, і багатьох білків Є. coli.

2. Енергетичні вимоги до перенесення. Як правило, перенесення білків у мембрани або через них енергозавісім. Необхідною умовою переносу як для прокаріотів, так і для еукаріотіче-ських систем є гідроліз АТР. . coli . Це було показано для наступних процесів: а) перенесення білків в строму хлоропластів; б) транспорту білків у мітохондріальний матрикс, внутрішню і зовнішню мембрани; в) перенесення білків через ендоплазматичний ретикулум дріжджів і пост-трансляційного вбудовування мембранного білків в ендоплазматичний ретикулум ссавців; г) перенесення білків через цитоплазматичну мембрану E. coli. Ні в мітохондріях, ні в мембранах Є. coli АТРазною активність не належить АТРази та її роль не полягає в генеруванні трансмембранного потенціалу.

Ще одним незалежним умовою перенесення білків в матрикс мітохондрій і у внутрішню мембрану мітохондрій є наявність на останній трансмембранного потенціалу. Цей потенціал, очевидно, необхідний на ранній стадії процесу, при зв'язуванні білка з мітохондрій. Для транспорту принаймні деяких білків у хлоропласт ця умова не є обов'язковим. . coli Однак для оптимізації перенесення білків через плазматичну мембрану E. Coli також потрібна трансмембранний протондвіжущая сила. Зауважимо, що напрям переносу білків щодо полярності в Є. coli і мітохондріях протилежно, а чи має мембрана ендоплазматичного ретикулума трансмембранний потенціал - невідомо.

3. Здатність попередника до перенесення. Є вагомі аргументи на користь того, що ключову роль в успішному перенесення білка грає його четвертинна структура. Швидше за все це пов'язано з тим, що сигнальна послідовність, впізнавана апаратом перенесення, повинна бути доступна для нього. Отже, для здійснення переносу білок повинен бути нещільно згорнутий або частково розгорнуто. Крім того, якщо білки переносяться через мембрану у витягнутій конформації, то апарат перенесення повинен бути здатний до їх розгортання під час самого процесу переносу. Якби білки-попередники мали стабільної четвертинної структурою, то вони з працею розгорталися б і, отже, не були здатні до переносу.

Найбільш чіткі дані про те, що білки транспортуються у витягнутій конформації, отримані в роботі, авторам якій вдалося ідентифікувати інтермедіати при перенесенні двох різних білків в матрикс мітохондрій. -кон-цы этих интермеднатов погружены в матрикс, а основная их часть находится вне митохондрии. Було показано, що N-кон-ці цих інтермеднатов занурені в матрикс, а основна їх частина знаходиться поза мітохондрії. Таким чином, інтермедіати повинні простягнутися через внутрішню і зовнішню мембрани; при цьому вважають, що місце їхнього входу збігається з місцем злиття двох мембран.

Білки можуть транспортуватися через мембрану тільки в розгорнутому вигляді

Шац та ін вивчали перенесення через мембрану тетрагі-дрофолатредуктази, до якої була штучно приєднана мітохондріальна сигнальна послідовність; без цієї послідовності білок не міг проникати в мітохондрії. Після впровадження в матрикс мітохондрії сигнальна послідовність віддалялася сигнальної пептидаз. Щоб з'ясувати, чи може проходити через мембрани мітохондрій білок, що знаходиться у згорнутій конформації, вимірювали ефективність транспорту в присутності метотрексату - інгібітора, який з високою вибірковістю зв'язується з нативною формою тетрагідрофолатредуктази. Виявили, що зв'язування метотрексату призводить до припинення транспорту, можливо внаслідок того, що інгібітор стабілізує фермент у компактній формі. -АТРазы необходимо его развертывание. Було показано також, що для проникнення в мітохондріальний матрикс попередника 0 - субодиниці FiFo-АТРази необхідно його розгортання.

Вивчався транспорт в мітохондрії укорочених попередників тетрагідрофолатредухтаеи. Вони містили мітохоі-дріальную сигнальну послідовність, але трансляція була перервана до завершення синтезу поліпептиду. Такі укорочені попередники не пов'язували метотрексат, а можливо, і ие могли згортатися в конформацію, подібну нативної. Однак вони проникали в мітохондрії. . Особливий інтерес представляв той факт, що транспорт укорочених попередників на відміну від транспорту повнорозмірного білка міг здійснюватися за відсутності ATP. необходим для разворачивания полипептида. Це ще раз підтверджувало той факт, що ATP необхідний для розгортання поліпептиду. На рис. 10.8 схематично представлена ​​модель процесу переносу білків в мітохондрії із зазначенням стадій, що протікають лише при наявності трансмембранного потенціалу і АТР.

До аналогічних висновків про роль АТР призвело дослідження транспорту поріна в зовнішню мітохондріальну мембрану. Цей білок не має відщеплюється сигнальної послідовності, і вся необхідна для транспорту інформація закодована всередині молекули зрілого білка. Білок був виділений у водорозчинній формі, ймовірно частково денатурованою, але і в такому вигляді був здатний до перенесення. Перенесення водорозчинного попередника не вимагав АТР. Цим він відрізнявся від білка, який проникав у мітохондрію відразу по завершенні синтезу в системі in . vitro. Мабуть, і в цьому випадку АТР потрібно для активного процесу розгортання білкової молекули.

Перенесення білка, що зв'язує мальтозу, через плазматичну мембрану £. Coli в періплазматіческое простір теж залежить від конформації попередника. Так, мутаітний білок із зміненою сигнальної послідовністю, ие здатний до транспорту, менш чутливий і до протеолитическому розщепленню, тобто більш щільно згорнутий. Білок ж, більшою мірою схильна протеолізу, здатний і до перенесення. Це узгоджується з даними по мітохондрій. -конце замедляется укладка полипептида. Мабуть, за наявності сигнального пептиду на N-кінці сповільнюється укладання поліпептиду. Цікавий той факт, що мутація в сигнальний пептид, що призводить до блокування переносу, може супрессіроваться друге мутацією в зрілому білку. Попередник, що несе обидві мутації, значно менш стабільний у цитоплазмі, ніж молекули з одного мутацією в сигнальній послідовності, можливо, через те, що він знаходиться у більш розгорнутій конформації.

Обговорювалося і питання про те, що, мабуть, для запобігання згортання попередника в нативну конформацію необхідний якийсь розчинний білковий кофактор. Так, був виділений у водорозчинній формі, схожій з поріном мітохондрій, попередник білка зовнішньої мембрани Є. coli , который был не способен к эффективному переносу через плазматическую мембрану, если в цитозоле отсутствовал белок, называемый «триггер-фактором». OmpA, який був не здатний до ефективного переносу через плазматичну мембрану, якщо в цитозолі відсутній білок, званий «тригер-фактором». Давно відомо, що для перенесення білків через мембрани ендоплазматичного ретикулуму ссавців або в ендоплазматичний ретикулум необхідний розчинна кофактор, а саме - сигнал-розпізнає частинка. Можливо, роль цього чинника полягає в запобіганні згортання попередника поліпептиду.

4. ЧИ ПОТРІБНІ ДЛЯ ПЕРЕНЕСЕННЯ БІЛКІВ КАНАЛИ?

Експериментальні дані, які однозначно свідчили б про існування каналів, які беруть участь у складанні мембранних білків або в перенесенні білків через мембрану, відсутні. Відомо, втім, що як на поверхні мітохондрій, так і в ЕПР є мембранні рецептори, які специфічно впізнають стерпні білки, і, можливо, саме вони є частиною складного апарату, куди входить і канал, по якому переміщається білок.

Для того, щоб перенесення білків відбувався зі швидкістю, близькою до швидкості синтезу поліпептиду, енергетичний бар'єр не повинен перевищувати приблизно 18 ккал / моль. За даними роботи, дві сусідні спіралі можуть спонтанно вбудовуватися в бішар з утворенням спіральної шпильки, і відповідний виграш вільної енергії - 60 ккал / моль може стати рушійною силою для часткового втягування полярних і навіть заряджених груп в ліпідний бішар. Однак для перенесення іонізованих і полярних груп з водного оточення в ліпідний бішар необхідна більша кількість вільної енергії, н навряд чи модель спонтанного вбудовування буде застосовна завжди, оскільки при складанні багатьох мембранних білків необхідно транспортувати через мембрану довгі, часто сильно заряджені полнпептідние ланцюга.

Тим не менше було показано, що деякі невеликі мембранні білки включаються до лнпідние біслон спонтанно. До них відносяться цитохром Ь $ з єдиним гідрофобним якорем на С-кінці і пробелок оболонки бактеріофага М13, імовірно містить дві трансмембранні спіралі, які, можливо, і вбудовуються в бішар з утворенням спіральної шпильки або петлі. . Зрелый белок имеет кислый N -конец, обращенный в периплазматическое пространство, трансмембранный сегмент и основный С-конец, обращенный в цитоплазму. Пробелок оболонки містить сигнальну послідовність з 23 залишків, зазвичай відщеплюється при складанні в цитоплазматичній мембрані Є. coli. Зрілий білок має кислий N-кінець, звернений у періплазматіческое простір, трансмембранний сегмент і основний С-кінець, звернений в цитоплазму. Він спонтанно вбудовується в фосфоліпідних ліпосоми, причому швидкість його складання in сильно замедляется, если в трансмембранном участке или на С-конце зрелого белка имеются мутации, что согласуется с моделью, в рамках которой два гидрофобных сегмента могут спонтанно встраиваться в липидный бислой в виде шпильки или петли. vivo сильно сповільнюється, якщо в трансмембранному ділянці або на С-кінці зрілого білка є мутації, що узгоджується з моделлю, в рамках якої два гідрофобних сегмента можуть спонтанно вбудовуватися в ліпідний бішар у вигляді шпильки або петлі. На рис. 10.9 представлена ​​схема вбудовування цього білка в мембрану. Цікаво, що збірка пробелкой оболонки вірусу М13 може здійснюватися і з допомогою мікросом ссавців, причому цей процес вимагає АТР, віз

, поскольку он имеет отщепляемую сигнальную последовательность, и его сборка происходит независимо от функций генов secA , secY , необходимых для переноса белков внутрь плазматической мембраны или через нее . можна, для підтримки необхідної для транспорту конформації. Слід зазначити, що цей білок не типовий для білків, збірка яких здійснюється на плазматичної мембрани £. coli, оскільки він має відщеплюється сигнальну послідовність, і його збирання відбувається незалежно від функцій генів secA, secY, необхідних для перенесення білків всередину плазматичної мембрани або через неї.

Результати дослідження пробелкой оболонки бактеріофага М13 переконливо проілюстрували справедливість механізму мимовільного вбудовування білків у мембрану без участі білків-посередників. Передбачається, що водорозчинний попередник набуває конформацію, що забезпечує вбудовування його в мембрану, при взаємодії з бішару. Ця узагальнена модель була запропонована як частина «мембранної критичної гіпотези». Схожий механізм був запропонований для збірки принаймні якихось дільниць більш складних мембранних білків, наприклад переносника глюкози. Зауважимо, що механізми самовільного вбудовування шляхом утворення петлі або спіральної шпильки можуть розглядатися тільки в тих випадках, коли немає тісного поєднання між мембранним переносом і трансляцією.

Ще один приклад, який ілюструє важливу роль мимовільного вбудовування в ліпідний бішар при перенесенні, - це апо-цитохром с, попередник мітохоідріальіого цитохрому с. Оі ие відрізняється по довжині від зрілого цитохрому с, але позбавлений ковалентно зв'язаного гема з, який приєднується до молекули тільки після перенесення білка через зовнішню мітохондріальну мембрану. Зрілий білок міститься в міжмембранну просторі мітохондрій. Показано, що апоцітохром с, зв'язуючись з аніонними ліпідами в фосфоліпідних везикулах, може проникати в ліпідний бішар і перетинати його. Механізм такої чудової активності до кінця невідомий, можливо, при цьому відбувається істотне перегрупування ліпідів. Дивно, що в цьому поліпептиди немає протяжних гідрофобних ділянок і 40% амінокислотних залишків заряджені!

Чи можливо застосувати дані, отримані на штучних фосфолі-ліпідних везикулах, до систем in , неясно, но, согласно одной из моделей, апоцитохром с должен проникнуть в наружную мембрану достаточно глубоко для того, чтобы он мог связаться со специфическим белковым рецептором на внутренней поверхности мембраны. vivo, неясно, але, згідно однієї з моделей, апоцітохром з повинен проникнути в зовнішню мембрану досить глибоко для того, щоб він міг зв'язатися зі специфічним білковим рецептором на внутрішній поверхні мембрани. Втім, при цьому не виключається наявність каналу. In ковалентное присоединение гема удерживает зрелый белок в межмембранном пространстве и, возможно, приводит к конфор-мационным изменениям, необходимым для дальнейшего переноса. vivo ковалентное приєднання гема утримує зрілий білок в міжмембранну просторі і, можливо, призводить до конфор-Інформаційним змін, необхідним для подальшого перенесення.

До мимовільного вбудовуванню в ліпідні бішар і біомембрани здатні і багато інших водорозчинні білки, хоча механізм такого вбудовування залишається невідомим. Основними представниками є токсини і білки, що утворюють пори. Всі побудовані моделі зазвичай припускають, що в білку відбуваються конформаційні зміни, в результаті яких гідрофобні залишки, заховані усередині водорозчинній структури, експонуються в ліпідний бішар при включенні в нього білка. Прикладами такого роду служать а-токсин з Staphylococcus , компонент комплемента С9 и ко-лицин А. Во многих случаях для инициации конформационно-го перехода необходимо понизить рН. aureus, компонент комплементу С9 і ко-Ліциній А. У багатьох випадках для ініціації конформаційно-го переходу необхідно знизити рН. Навряд чи ці токсини і білки, що утворюють пори, можуть служити модельними системами, придатними для вивчення збірки багатьох мембранних білків. Проте вони чітко показують, що водорозчинні попередники дійсно можуть мимовільно укладатися всередині бішару, утворюючи складні трансмембранні біохімічно активні зрілі форми.

Таким чином, якщо мова йде про перенесення лінійно витягнутого полнпептіда, то при енергетичних розрахунках необхідно грунтуватися на наявності пори, заповненої водою, чи каналу, здатного забезпечити гидрофильное оточення для заряджених або полярних груп. Ця модель є прийнятною для більшості білків, хоча є численні приклади, коли відбувається мимовільне включення окремих спіралей або доменів в ліпідний бішар. Якщо специфічні канали для перенесення білків дійсно існують, вони повинні бути дуже хитро влаштовані, оскільки через них проходять практично будь-які поліпептнди і затримуються іони і невеликі ме таболіти. Дослідження таких пір методом Петч-клампи не проводилося.

5. Поліпептидні СИГНАЛИ, ВІДПОВІДАЮТЬ за сортування БІЛКІВ І ВБУДУВАННЯ ЇХ У МЕМБРАНИ

Про апарат і механізм перенесення ми не знаємо майже нічого; трохи більше відомо про сигнальні послідовностях, присутніх у поліпептидів і напрямних кожен білок в потрібне місце. Успіхів у цій галузі вдалося досягти завдяки використанню техніки рекомбінантних ДНК. З її допомогою були сконструйовані гібридні поліпептиди, в які була включена тестуєма амінокислотна послідовність, що належить іншого білка. Таким чином можна було вивчати вплив передбачуваної сигнальної послідовності на локалізацію «білка-пасажира». Переваги такого підходу вдається використовувати тільки в тому випадку, якщо вся інформація, яка визначає локалізацію кінцевого продукту, укладена в первинній послідовності сигналу і якщо «білок-пасажир» є нейтральним учасником процесу і, що суттєво, підпорядковується сигналу. Ця умова виконується в багатьох випадках, але відомі і такі приклади, коли ефективність переносу або навіть кінцева локалізація залежать від «білка-пасажира». Якщо «білок-пасажир» знаходиться в конформації, не здатної до перенесення, то може відбуватися блокування переносу химерного білка. Крім того, функція деяких сигнальних послідовностей залежить від їх локалізації в поліпептидами від взаємодій з іншими ділянками поліпептидного ланцюга. Незважаючи на всі ці труднощі, вдалося отримати багато цінних даних про різноманітність сигнальних послідовностей.

Сигнальна послідовність, що визначає вбудовування в ендоплазматичний ретикулум

-конце имеется «корот-коживущий» сигнальный пептид. У більшості білків, вбудованих в мембрану ендоплазматичного ретикулума або перетинають її, на N-кінці є «корот-кожівущій» сигнальний пептид. Ця сигнальна послідовність безпосередньо взаємодіє принаймні з двома рецепторами, один з яких розчинний, а інший знаходиться в мембрані. Можна було б очікувати, що амінокислотна послідовність цього сигнального пептиду буде дуже консервативною і приблизно однаковою у всіх переносимих білків, але очікування ці не виправдалися. Ці сигнальні ділянки не відрізняються сталістю ні щодо довжини, ні щодо амінокислотної послідовності, а численні досліди по мутагенезу показали, що вони можуть зазнавати значні структурні зміни. Дані про те, що сигнальні пептиди містять всю інформацію, необхідну для транспорту білків через мембрани ендоплазматичного ретикуло-ма або всередину їх, були отримані у дослідах з химерними поліпептидами. -концевой сигнальной последовательности к обычным цитоплазматическим белкам, например к глобину, приводило к тому, что они транспортировались в полость эндоплазматического ретикулума. Приєднання N-кінцевий сигнальної послідовності до звичайних цитоплазматическим білкам, наприклад до глобіну, призводило до того, що вони транспортувалися в порожнину ендоплазматичного ретикулуму.

-концевых сигнальных последовательностей можно выделить три разных в структурном отношении участка: 1) положительно заряженный N -концевой участок; 2) центральное гидрофобное ядро из 7—15 остатков; 3) С-концевой участок, который является полярным и содержит сайт, узнаваемый сигнальной пепти-дазой, которая находится на стороне эндоплазматического ретикулума, обращенной в полость. З точки зору «порівняльної анатомії» N-кінцевих сигнальних послідовностей можна виділити три різні в структурному відношенні ділянки: 1) позитивно заряджений N-кінцевий ділянку; 2) центральне гідрофобна ядро з 7-15 залишків; 3) С-кінцевий ділянка, яка є полярним і містить сайт, впізнаваний сигнальної пепто-дазою, яка знаходиться на стороні ендоплазматичного ретикулума, оберненою в порожнину. Показано, що численні випадкові послідовності здатні виконувати функцію нормального сигнального пептиду у інвертази дріжджів і детермінувати її секрецію. Аналіз цих випадкових послідовностей показав, що вирішальним чинником є їх гідрофобність. На рис. 10.10 наведені дані про гідрофобності і довжині гідрофобних ділянок відомих сигнальних пептидів еукаріот і більшості гідрофобних ділянок, виявлених у цитозольних білках еукаріотів, а також відомих трансмембранних якірних ділянок мембранних білків. -область обладает свойствами, промежуточными между свойствами соответствующих участков цитозольных белков, с одной стороны, и типичных трансмембранных сегментов — с другой. З цих даних видно, що h-область має властивості, проміжними між властивостями відповідних ділянок цитозольних білків, з одного боку, і типових трансмембранних сегментів - з іншого.

Очевидно, структурна специфічність для процесу впізнавання не відіграє суттєвої ролі. Однак необхідно пам'ятати, що зміна вільної енергії менше ніж на 5 ккал / моль відповідає зміні спорідненості в 1000 разів. Така відмінність в спорідненості цілком може бути обумовлено тонкими відмінностями між функціональними і нефункціональними сигнальними послідовностями. - A 2, трехмерная структура которого известна. Моделлю рецептора сигнального пептиду може служити розчинна фрагмент антигену гісто © сумісності класу I, а саме HLA - A 2, тривимірна структура якого відома. Цей білок зв'язується з пептидами - компонентами чужорідних антигенів, що є

частиною імунної відповіді. Область зв'язування пептиду являє собою великий жолобок, відкритий з одного кінця і здатний вміщати пептид з 20 амінокислотних залишків, якщо той має форму а-спіралі. - A 2, известно немного; показано, в частности, что близкородственный антиген гист©совместимости класса II проявляет высокое сродство к самым разным аминокислотным последовательностям. Про пептидах, які можуть зв'язуватися з HLA - A 2, відомо небагато; показано, зокрема, що близькоспоріднений антиген гісто © сумісності класу II проявляє високу спорідненість до самих різних амінокислотним послідовностей. Мабуть, найбільш важливими ббщімі характеристиками пептидів, які можуть зв'язуватися з високою спорідненістю, є вторинна структура і амфіфільних. Стабілізації комплексу можуть сприяти численні взаємодії в області зв'язування.

Відомо, що відносно невеликі відмінності між сигнальними послідовностями породжують величезні відмінності в поведінці білка. Наприклад, якщо сигнальна послідовність не розпізнається сигнальної пептидаз, то білок частіше залишається пов'язаним з мембраною, ніж секретується, хоча є й винятки з цього правила. -концевыми якорями, Зазвичай сигнальні послідовності, які служать також N-кінцевими якорями,

-участок длиной около 20 аминокислотных остатков; этот участок необходим для остановки переноса и/или образования стабильного якоря в мембранном бислое. мають більш протяжний гідрофобний h-ділянка завдовжки близько 20 амінокислотних залишків; цю ділянку необхідний для зупинки перенесення і / або освіти стабільного якоря в мембранному бішарі. Прикладом такої сигнальної / якірної послідовності служить трансферріновий рецептор. -конце, а на расстоянии более чем 50 аминокислотных остатков от него. Зауважимо, що в цьому випадку сигнальна послідовність розташована не иа N-кінці, а на відстані більше ніж 50 амінокислотних залишків від нього.

-конец оказывается обращенным наружу. Відомі також випадки, коли сигнальна послідовність закріплює зрілий білок у протилежної орієнтації, тобто N-кінець виявляється зверненим назовні. . viridis . Як приклад можна навести цитохром Р450 мікросом щури, інваріантну церь антигенів гістосумісності класу II миші, кілька вірусних білків і Н-субодиницю реакційного центру R. Viridis. -коиец через мембрану и останавливают трансляцию, так что основная часть белка остается в цитоплазме . Отмечалось, что в некоторых из этих случаев сигнальные последовательности «старт/стоп» несут, по крайней мере, одни отрицательный заряд в n -области. Якимось чином ці сігналь-ние/якоріие послідовності «проштовхують» свій N-коіец через мембрану і зупиняють трансляцію, так що основна частина білка залишається в цитоплазмі. Зазначалося, що в деяких з цих випадків сигнальні послідовності «старт / стоп» несуть, принаймні, одні негативний заряд в n-області. Однак для вбудовування зазначених мембранних білків, як і білків звичайного типу, використовується однаковий апарат перенесення - СРЧ. -концевых остатков через мембрану. Можливо, наявність негативного заряду полегшує мимовільний або опосередкований білком перенесення N-кінцевих залишків через мембрану.

-конце белковой молекулы и могут направлять перенос обоих фланкирующих домеиов, по крайней мере в случае искусственных гибридных белков. Як ми вже відзначали, сигнальні послідовності не обов'язково знаходяться на N-кінці білкової молекули і можуть направляти перенесення обох фланкують будинку, принаймні у випадку штучних гібридних білків. Унікальним прикладом такого роду є овальбумін, секреція якого детермінується неотщепляемой внутрішньої сигнальної послідовністю. У багатьох мембранних білків ендоплазматичного ретикулума неотщепляемие сигнальні послідовності теж розташовані в середній частині поліпептидів ланцюга і грають роль трансмембраніих якорів. Як приклад можна навести асіалоглікопротеіновий рецептор. -концевая последовательность; и действительно, в искусственных гибридах эта внутренняя сигнальная последовательность функционирует как обычная N -концевая последовательность. Внутрішня сигнальна послідовність цього білка використовує той же апарат перенесення, що і N-кінцева послідовність; і дійсно, в штучних гібридах ця внутрішня сигнальна послідовність функціонує як звичайна N-кінцева послідовність. -конец которых находится на внутренней стороне мембраны, служат переносчик глюкозы и анионный переносчик белок полосы 3 . Напротив, у опсина, тоже содержащего внутренний неотщепляемый сигнальный пептид, N -конец находится с наружной стороны мембраны . Этот внутренний сигнал протягивает гидрофильный аминокислотный домеи через мембрану, и, таким образом, его ориентация противоположна той, которая наблюдается в более общем случае при переносе полипептида, начиная с С-конца. Прикладами білків з внутрішньої неотщепляемой сигнальної послідовністю, які мають численні трансмембраніие сегменти і N-кінець яких знаходиться на внутрішній стороні мембрани, служать переносник глюкози і аніонний переносник білок смуги 3. Навпаки, у опсина, теж містить внутрішній неотщепляемий сигнальний пептид, N-кінець знаходиться з зовнішнього боку мембрани. Цей внутрішній сигнал простягає гідрофільний амінокислотний домеі через мембрану, і, таким чином, його орієнтація протилежна тій, яка спостерігається в більш загальному випадку при переносі поліпептиду, починаючи з С-кінця. -концевого пептида. Причина такої поведінки опсина невідома, можливо, важливу роль відіграє природа N-кінцевого пептиду.

-конца мембранного белка. Отже, від невеликих змін в сигнальних послідовностях залежить, чи буде «білок-пасажир» секретуватися в порожнину ендоплазматичного ретикулума або ої залишиться прикріпленим до мембрани, н якою буде орієнтація N-кінця мембранного білка. Було показано, що існують всі можливі топологічні варіанти. Важливим моментом є те, що у всіх випадках збірка здійснюється за допомогою одного й того самого апарата.

Стоп-сигнали перенесення

-концевых якорей в образовавшемся мембранном белке, характерно наличие относительно длинных гидрофобных участков. Для неотщепляемих сигнальних послідовностей, які грають роль N-кінцевих якорів в утворився мембранному білку, характерно наявність відносно довгих гідрофобних ділянок. Звідси випливає, що перенесення може зупинятися просто при наявності протяжного гідрофобного ділянки, який здатний утворити трансмембранну а-спіраль. На користь такого припущення свідчать деякі експериментальні дані. , в норме секретирующегося через плазматическую мембрану, встраивали гидрофобные сегменты. Наприклад, за допомогою рекомбінантної ДНК в середню частину білка Є. coli, в нормі секретується через плазматичну мембрану, вбудовували гідрофобні сегменти. Якщо їх довжина була не менше 16 амінокислотних залишків, то транспорт білка блокувався, і він залишався приєднаним до плазматичної мембрани. Можна заперечити, що в даному випадку мова йде про бактеріальну системі, але, як ми побачимо нижче, механізми переносу в про-і еукарі-отіческіх системах, мабуть, подібні. -белка вируса везикулярного стоматита с измененными мембранными доменами. Далі були сконструйовані варіанти G-білка вірусу везикулярного стоматиту зі зміненими мембранними доменами. Довжина гідрофобного сегмента могла становити не 20, а 8 залишків, при цьому поліпептид залишався трансмембранним, хоча транспорт в плазматичну мембрану блокувався. Таким чином, природа стоп-сигналу переносу точно не відома. Необхідно з'ясувати два питання: 1) чи беруть участь у зупинці процесу специфічні білки апарату перенесення, 2) чи визначається зупинка перенесення гідрофобіостью стоп-сигнал, або якимось більш тонкими чинниками? Було показано, що ділянки стоп-сигналів послідовності, відповідальні за блокування переносу через ендоплазматичний ретикулум, можуть ніяк не впливати на транспорт через мембрану хлоропласта. Це означає, що згадані два процеси можуть істотно різнитися.

-конца; об этом свидетельствует поведение простых систем. Визначення старт-і стоп-сигналів на увазі лінійну схему переносу, що починається з N-кінця; про це свідчить поведінка простих систем. Однак виявилося, що послідовності, які блокують перенесення в одному випадку, можуть ініціювати його в іншому. Отже, важлива не тільки природа самих стоп-або старт-послідовностей, але і їхнє оточення в поліпептиди.

Вторинні сигнали екеоцітозной системи

Функція сигнального пептиду полягає у спрямуванні білків в ендоплазматичний ретикулум і в ініціації переносу. З рис. 10.1 видно, що як мембранні білки, так і розчинні білки, які потрапляють у порожнину ендоплазматичного ретикулума, мають декілька місць призначення. Інформація, яка визначає їх локалізацію, якимось чином кодується в зрілому поліпептиди. У відсутність вторинного сигналу водорозчинні білки секрети-ються за допомогою «конститутивний» секретирующий системи. Досягнуто певних успіхів в ідентифікації сигналів, відповідальних за направлення розчинних білків у Лизо-соми або секреторні гранули або за утримання їх у ендоплаз-ному ретикулумі або бульбашках Гольджі. Можливо, ділянки цих поліпептидів взаємодіють з мембранними рецепторами, викликаючи уповільнення їх експорту.

Про сигнали, відповідальних за локалізацію інтегральних мембранних білків у екеоцітозной системі, відомо небагато. Мабуть, за фіксацію білка Е19 аденовірусу в мембрані ендоплазматичного ретикулума відповідає коротка послідовність на С-кінці молекули. Цей білок має єдиний трансмембранний сегмент і цитоплазматичний «хвіст» з 15 залишків на С-кінці. Зменшення довжини «хвоста» тільки на вісім амінокислотних залишків призводить до транспорту білка з ендоплазматичного ретикулуму. Можливо, сигнальний ділянку взаємодіє прямим або непрямим чином з якоюсь цитоплазматичної структурою, що забезпечує заякоріваніе білка Е19 в ендоплаз-ному ретикулумі. Дослідження глікопротеїну Е1 коронаві-руса показали, що сигнальна послідовність, відповідальна за його знаходження в апараті Гольджі, локалізована в одній з трьох передбачуваних трансмембранних спіралей.

Подібна проблема сортування виникає при виявленні вторинних сигналів, відповідальних за направлення мембранних білків в потрібний домен плазматичної мембрани в поляризованих епітеліальних клітинах. У цій роботі використовувалися в основному віруси з оболонкою, які відокремлюються або від апікальної, або від базолатеральной поверхні епітеліальних клітин в культурі. -белок вируса везикулярного стоматита локализован исключительно в базолатеральной области мембраны, от которой вирус и отпочковывается, а гликопротеин гемагглютинина транспортируется к апикальной области. Так, G-білок вірусу везикулярного стоматиту локалізована виключно в базолатеральной області мембрани, від якої вірус і відгалужується, а глікопротеїн гемаглютиніну транспортується до апікальної області. Химерний гібрид,

Таблиця 1. Сигнали для сортування білків в еукаріотичних клітинах



Нант амінокислотної послідовності




невідомі


2.

Ендоплазматіче-

Коротка послідовність на С-



ський ретикулум

коіце відповідає за утримання деяких




мембранних компонентів і компонентів




просвіту ендоплазматичного ретикулума


3.

Апарат Гольджі

Сигнальна послідовність знаходиться

[899)



в одному з трансмембраніих сегментів




глікопротеііа Е1 короіавіруса


4.

Апикальная або ба-

У деяких випадках сигнал, визначаю-

[937, 958,


золатеральная про-

щий кінцеву локалізацію, містить

1186]


ласть плазматіче-

внецітоплазматіческій домеі, але якусь



ської мембрани

то роль може також грати цито-




плазматичний домен


5.

Секреторні

Сигнал для тріпсіногеіа не вимагає наяв-

(1249]


гранули

чия сигнального пептиду (первинний сиг-




нал) або перших 12 амінокислотних




-коице нативиого белка залишків на N-коіце Натів білка


6.

Конститутивні

Скорочений шлях у відсутність вторинний-



секреція

них сигналів


-белка, локализуется исключительно в апикальной области мембраны. складається з внецітоплазматіческого домену НА, а також мембранного сегмента і цитоплазматичного «хвоста» G-білка, локалізується виключно в апікальній області мембрани. Ці та інші експерименти свідчать про те, що вирішальне значення для локалізації має внецітоплазматіческій домен. Однак існують дані про те, що цитоплазматичний домен теж може містити важливі сортувальні детермінанти. Мабуть, сортування білків плазматичної мембрани в поляризованих епітеліальних клітинах відбувається в апараті Гольджі. Однак у гепатоцитах щура спостерігається інша картина: всі білки плазматичної мембрани, очевидно, направляються спочатку в базолатеріальную область.

Істотно, що вторинні сортують детермінанти містяться в середній частині зрілого поліпептиду і не є спорідненими і навіть не є сусідами з первинним сигнальним пептидом, відповідальним за початкову локалізацію в ЕПР. Цим вони відрізняються від більшості вторинних сортують сигналів мітохондрій і хлоропластів, а також, ймовірно, бактерій.

Сигнали переносу і сортування у бактерій

. Белок, синтезируемый в цитоплазме, может направляться к цитоплазматической мембране, в периплаз-матическое пространство или в наружную мембрану. Більшість робіт зі складання та перенесенню мембранних білків були виконані на Є. coli. Білок, який синтезується в цитоплазмі, може направлятися до цитоплазматичній мембрані, в періплаз-автоматично простір або в зовнішню мембрану. Перенесення білків через внутрішню мембрану в періплазматіческое простір або зовнішню мембрану часто називають експортом. Крім того, деякі білки транспортуються через обидві мембрани і секретуються в зовнішнє середовище або стають компонентами пілей. В основному досліджувався експорт із бактеріальних клітин, який має багато спільного з імпортом в ендоплазматичний ретикулум.

-конце-вые сигнальные пептиды, весьма сходные с пептидами секретируе-мых белков, которые импортируются в эндоплазматический ретикулум эукариотических клеток. И в самом деле, сигнальные пептиды про- и эукариот до определенной степени взаимозаменяемы и узнаются в гетерологических системах. Як правило, білки, які направляються до періплазматіческое простір нли в зовнішню мембрану, мають тимчасові N-кінці-ші сигнальні пептиди, дуже подібні з пептидами секретіруе-мих білків, які імпортуються в ендоплазматичний ретикулум еукаріотичних клітин. І справді, сигнальні пептиди про- і еукаріот до певної міри взаємозамінні і впізнаються в гетерологічної системах. Наприклад, сигнальний пептид ліпопротеїну зовнішньої мембрани Є. coli прискорює перенесення білків через мікросоми тварин клітин. Сигнальні пептиди еукаріот і відомі сигнальні пептиди прокаріотів негомологичностью. За дуже рідкісним винятком, білки плазматичної мембрани не містять відщеплюється сигнального пептиду. , и пенициллинсвязывающие белки, которые локализуются не только в цитоплазматической мембране. До таких винятків належать білок оболонки фага М13, що не походить з Є. coli, і пеніцилін білки, які локалізуються не тільки в цитоплазматичній мембрані. Генетичні дані підтверджують, що в основі перенесення експортованих білків і збірки білків плазматичної мембрани лежать однакові біохімічні механізми і здійснюються ці процеси відповідно з подібними механістичним принципами.

Навпаки, механізм секреції білків через цитоплазматичну і зовнішню мембрани може бути зовсім іншим. -конце. Наприклад, у гемолизина сигнальна послідовність, що визначає секрецію, знаходиться иа С-кінцевій ділянці завдовжки 27 амінокислот, а не на N-кінці. Чудово, що серекція токсину, продукованого грамнегативної бактерією Vibrio , через наружную мембрану происходит только после свертывания полипептида с образованием третичной и четвертичной структуры в периплазма-тическом пространстве. cholerae, через зовнішню мембрану відбувається тільки після згортання поліпептиду з утворенням третинної і четвертинної структури в периплазмі-тичної просторі.

, secB , За даними генетичного аналізу, існує не менше чотирьох генів, продукти яких необхідні для перенесення більшості білків оболонки через цитоплазматичну мембрану: secA, secB, secY . і secD. Продукти генів secA і secY беруть участь у складанні принаймні деяких білків цітоплазматі-чеський мембрани, таких, як лідерних пептідаза. Функції продуктів цих генів невідомі; можливо, вони безпосередньо беруть участь у перенесенні білків. Біохімічні дослідження, що проводяться в цій області, набагато більш трудомісткі, ніж генетичні. Роботи з використанням мутантів, дефектних за серекціі білків, не виявили ніяких механістичних деталей; тим не менш отримані дані підтвердили наявність тісного зв'язку між процесами секреції і трансляції білків in . vivo. Про таку зв'язку свідчать і біохімічні дані, хоча в деяких випадках in белок включается в мембрану по завершении трансляции. vivo білок включається в мембрану по завершенні трансляції. Проте продукт гена secY здатний до посттрансляційної функціонуванню. Можливо, він представляє собою мембранозв'язаних рецептор або каналообразующей-щий білок, взаємодіючий із сигнальним пептидом бактерій.

Додаткові детермінанти первинного сигналу

У деяких випадках наявність сигнального пептиду у експортованих білків досить для перенесення білків-пасажирів через ци-топлазматіческую мембрану. Прикладом може служити сигнальна послідовність у отрут. возможен лишь при наличии определенной части последовательности зрелого полипептида. З іншого боку, виявилося, що транспорт білка зовнішньої мембрани LamB можливий лише за наявності певної частини послідовності зрілого поліпептиду. Рендолл і ін показали, що мальтозосвязиваю-щий білок, синтезуючи на мембранозв'язаних рибосомах, не переноситься в періплазматіческое простір до тих пір, поки трансляція не пройде приблизно на 80%. Це вказує на певну роль різних частин зрілої послідовності в ініціації трансляції, хоча не виключаються й інші пояснення.

-коицевой сигнальной последовательности, по-видимому, необходимы какие-то структурные детерминанты. Дослідження, проведені на двох білках цитоплазматичної мембрани, білку оболонки фага М13 і лидерной пептидаз, показують, що для білків, крім N-коіцевой сигнальної послідовності, мабуть, необхідні якісь структурні детермінанти. Більш характерним білком цитоплазматичної Мембрани є лідер-пептідаза; її передбачувана топологія представлена ​​на рис. 10.12. ; его активный центр локализован на периплазматической стороне цитоплазматической мембраны. Цей фермент відповідальний за про-теолітіческое відщеплення сигнального пептиду від більшості експортованих білків Є. coli; його активний центр локалізований на періплазматіческой стороні цитоплазматичної мембрани. Молекула цього білка має два транс

мембранних сегмента і великий С-кінцевий домен, експонований в періплазматіческое простір. Делеція залишків 142-323 блокує перенесення неповного поліпептиду через цитоплазматичну мембрану, що узгоджується з поданням про важливу роль у перенесенні карбоксильної частини молекули. Поліпептид, позбавлений залишків 4-50, які утворюють перший трансмембраіний сегмент, як і раніше збирається в мембрані, а другий трансмембранний сегмент відіграє роль сигнального пептиду.

Таким чином, дослідження деяких білків Є. coli свідчить про те, що для переносу через цитоплазматичну мембрану необхідна інформація, закодована в такій структурі, яка знаходиться за межами сигнальної послідовності. Можливо, це просто відображає той факт, що штучні повн-пептидні конструкції, що використовуються у цих дослідженнях, мають конформацію, яка не сприяє переносу. А може бути, це пов'язано з наявністю характерних детермінант, необхідних для взаємодії з компонентами механізму перенесення.

Вторинні сигнали

Що направляє білки у внутрішню мембрану, періплазматіческое простір або зовнішню мембрану - невідомо. Генетичні дослідження, а також дані за конкурентними взаємодіям показують, що багато з цих білків використовують загальний біохімічний апарат переносу. Результати аналізу сигнальних пептидів свідчать про те, що невеликі зміни їх гідрофобності та розміру можуть приводити до істотних змін в локалізації стерпного білка. З іншого боку, сигнальна послідовність періплазматіче-ського білка може з успіхом заміщати сигнальну послідовність білка зовнішньої мембрани; це означає, що інформація про складання укладена в зрілому білку зовнішньої мембрани. Можливо, переміщення білка саме до плазматичної мембрани обумовлено просто наявністю стоп-сигналу. Згадаймо, що основні білки зовнішньої мембрани, у тому числі поріни, позбавлені гідрофобних трансмембранних сегментів.

Використання синтетичних сигнальних пептидів

наружной мембраны и исследовано их взаимодействие с модельными фосфолипидными мембранами и везикулами Е, coli . Синтезовано пептиди, що відповідають сигнальної послідовності дикого типу, а також мутантні сигнальні пептиди білка LamB зовнішньої мембрани і досліджено їх взаємодію з модельними фосфоліпідних мембранами і везикулами Е, coli. Показано, що пептид, відповідний сигнальної послідовності дикого типу, ефективно інгібує in перенос предшественников как периплазматического белка, так и белка наружной мембраны, а пептид, соответствующий мутантной сигнальной последовательности, дефектной по экспорту, не ингибирует перенос в бесклеточной системе. vitro перенесення попередників як періплазматіческого білка, так і білка зовнішньої мембрани, а пептид, відповідний мутантної сигнальної послідовності, дефектної з експорту, не інгібує перенесення в безклітинних системі. Це означає, що сигнальні пептиди дізнаються якийсь загальний рецептор у цитозольної або мембранної фракції. Крім того, ефективність зв'язування цих пептидів з модельними мембранами корелює з їхньою здатністю служити сигналом переносу. Кореляція між гідрофобністю сигнальної послідовності і здатністю ініціювати транслокацію виявляється і при використанні попередника мальтозосвязивающего білка.

Ці дані узгоджуються з моделлю, згідно з якою первинна сигнальна послідовність визначає локалізацію поліпептидного попередника в мембрані шляхом неспецнфіческіх взаємодій з ліпідного бішару, після чого здійснюється більш специфічне зв'язування з білковим рецептором. Подібна модель була запропонована для амфіфільних пептидних гормонів. Зауважимо, однак, що сигнальний пептид в тваринних клітинах до його зв'язування з мембраною взаємодіє з якимось розчинною рецептором. Яке значення для сигнального пептиду має його здатність зв'язуватися з ліпіду-ми - залишається неясним.

Інші сигнальні послідовності бактерій

. Особый интерес представляет уникальная сигнальная последовательность, содержащаяся в бактерио-родопсине Н. halobium . Этот белок синтезируется in Є дані про те, що у бактерій існують сигнали, відмінні від сигналів у Є. coli. Особливий інтерес представляє унікальна сигнальна послідовність, що міститься в бактеріо-родопсину Н. halobium. Цей білок синтезується in с N -концевым сигналом длиной 13 остатков, который в принципе может образовать амфифильную а-спираль. vivo з N-кінцевим сигналом довжиною 13 залишків, який в принципі може утворити амфіфільних а-спіраль. , и о его функционировании почти ничего не известно. Він сильно відрізняється від сигнальної послідовності Є. coli, і про його функціонування майже нічого не відомо.

Сигнальні проследовательності імпорту та сортування в мітохондріях

Білки мітохондрій і хлоропластів, інформація про яких закодована в ядрі, синтезуються у вигляді водорозчинних попередників на вільних рибосомах і in переносятся к месту назначения после трансляции. vivo переносяться до місця призначення після трансляції. У результаті сортування мито-хондріальние білки виявляються в зовнішній мембрані, межмембранное просторі, внутрішній мембрані або в матриксі. -конце. Експерименти з використанням химерних поліпептидів або поліпептидів, отриманих в результаті делецій, показали, що, як правило, достатня для імпорту і сортування інформація міститься на N-кінці. -концевыми препоследовательностя-ми, которые удаляются сигнальными пептидазами во время или после переноса. Більшість білків мітохондрій і хлоропластів синтезується з N-кінцевими препоследовательностя-ми, які видаляються сигнальними пептідаза під час або після перенесення. Ці препоследовательності містять інформацію, необхідну для імпорту і сортування. Наприклад, перші 22 амінокислоти IV субодиниці цитохром с-оксидази, приєднані до дигідрофолатредуктази миші, детермінують імпорт цито-зольного ферменту в матрикс мітохондрій. У загальному випадку за відсутності додаткових сигналів сигнал імпорту має направити білок-пасажир в матрикс. Це «укорочений» шлях, аналогічний конститутивний секреції білків, що імпортуються в ендоплазматичний ретикулум. Додаткові сигнали сортування, як правило, теж перебувають в препоследовательності, за сигналом імпорту. Наприклад, якщо препоследовательность цитохрому с приєднана до тетрагідрофолатредуктазе, то білок-пасажир локалізується в міжмембранну просторі. -конце полипептида. Навіть у тих небагатьох випадках, коли відщеплюється сигнальна послідовність відсутня, сигнали сортування та імпорту знаходяться на N-кінці поліпептиду. -конца. Втім, в деяких роботах є вказівки на те, що якусь роль в імпорті мітохондріальних білків відіграють послідовності, відмінні від тих, які розташовані поблизу N-кінця.

На рис. 10.13 підсумовані дані про структуру сигнальних послідовностей типових мітохондріальних білків. -конце находится последовательность, определяющая транспорт белков в матрикс, а также при необходимости содержится дополнительная сигнальная информация. У всіх них на N-кінці знаходиться послідовність, що визначає транспорт білків в матрикс, а також при необхідності міститься додаткова сигнальна інформація.

Білки зовнішньої мембрани

Найбільш детально вивчений білок зовнішньої мембрани дріжджів з мовляв. масою 70 кДа. -конец. Як і інші білки зовнішньої мембрани, він не містить відщеплюється сигнального пептиду, і сигнальної послідовністю, відповідальної за його транспорт у матрикс, служить N-кінець. Це було показано в дослідах з приєднання перших 12 амінокислот досліджуваного білка до цитозольних білків, в результаті чого білок-пасажир опинявся в матриксі мітохондрії. Сигнал сортування, який визначає локалізацію білка мовляв. масою 70 кДа в зовнішній мембрані, мабуть, являє собою сегмент з 28 незаряджених амінокислот, що примикає до сигнальної послідовності, відповідальної за транспорт білка в матрикс. Поділу лише двох із цих незаряджених залишків призводить до транспорту білка в матрикс. Зауважимо, що мітохондріальний імпорт, мабуть, здійснюється через канали, що знаходяться в місцях з'єднання внутрішньої і зовнішньої мембран. На відміну від прикладу, наведеного на рис. 10.8, збірка білку з мовляв. масою 70 кДа не вимагає наявності трансмембранного потенціалу, що типово для білків зовнішньої мембрани. Найпростіша схема складання білка з мовляв. масою 70 кДа полягає в тому, що гідрофобну ділянку, що закріплює білок в зовнішній мембрані, грає роль стоп-сигналу переносу, в результаті основна частина білка залишається поза мітохондрії. Збірка іншого дослідженого білка зовнішньої мембрани, поріна з Neurospora , вероятно, осуществляется с,помощью другого механизма. crassa, ймовірно, здійснюється з, допомогою іншого механізму. Цей білок не містить гідрофобного ділянки і, подібно порінам бактерій, мабуть, представлений трансмембранної / 3-структурою.

Межмембранное нов простір

Типовим представником білків, що містяться в міжмембранну просторі, є цитохром Ьг. -концевая часть препоследовательности служит сигналом, направляющим целый полипептид в матрикс. Його пре-послідовність складається з 80 залишків, що становлять два різних ділянки. N-кінцева частина препоследовательності служить сигналом, що направляють цілий поліпептид в матрикс. Цей процес залежить від наявності потенціалу на внутрішній мембрані. У резуль-

-концевой участок препоследовательности удаляется и освобождается вторая часть сигнала, которая направляет полипептид обратно через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство. таті протеолитического процесингу, здійснюваного сигнальної пептидаз в матриксі, N-кінцевий ділянку препоследовательності віддаляється і звільняється друга частина сигналу, яка направляє поліпептид назад через внутрішню мембрану в межмембранное простір. Цей етап не потребує наявності мембранного потенціалу. В результаті другого акту протеолізу на зовнішній поверхні внутрішньої мембрани утворюється водорозчинна зріла форма білка. -комплекса, но в этом случае весь протеолитический процессинг осуществляется внутри матрикса. Подібним чином відбувається імпорт железосе-росодержащей себ'едініци Ризик bci-комплексу, але в цьому випадку весь протеолітичний процесинг здійснюється всередині матриксу. Зауважимо, що процес перенесення білків з матриксу дуже схожий на процес експорту білків з бактерій.

Для пояснення імпорту цитохрому с,, інший субодиниці ЬС \ - комплексу, були запропоновані два механізми. , другой представлен на рис. Один з них схожий з механізмом, описаним вище для цитохрому bi, інший представлений на рис. 10.14. -концевой сигнальной последовательностью, транспортируется в матрикс до тех пор, пока перенос не блокируется гидрофобным сегментом из 19 незаряженных остатков на С-кон-це препоследовательности. У цьому випадку препоследовательность дуже протяжна і дуже схожа на таку у цитохрому Ьг. Передбачається, що білок, що направляється N-кінцевий сигнальної послідовністю, транспортується в матрикс до тих пір, поки перенесення не блокується гідрофобним сегментом з 19 незаряджених залишків на С-кон-це препоследовательності. Білок закріплюється на внутрішній мембрані, як це схематично показано на рис. 10.14. Як тільки перенесення цитохрому С \ припиняється, дві сигнальні пептидази, одна в матриксі, а інша в межмембранное просторі, отщепляют препоследовательность, в результаті чого утворюється зрілий білок, який збирається в мультісуб'едінічний Ьокомплекс. Зрілий білок, ймовірно, фіксується у внутрішній мембрані за допомогою С-кінцевий гідрофобною спіралі. Зауважимо, що механізм імпорту цитохрому с у межмембранное простір, мабуть, унікальний. У цьому випадку відщеплюється препоследовательность відсутня; ймовірно, білок має свій власний специфічний рецептор.

Внутрішня мембрана

Мабуть, сигнал сортування у багатьох білків внутрішньої мембрани, що імпортуються з цитоплазми, може бути замінений відповідної гідрофобною послідовністю, що виконує функції стоп-сигналу переносу. -белка везикулярного стоматита сигнальной последовательности, определяющей транспорт в матрикс. Про це свідчить, зокрема, локалізація гібридного білка, отриманого шляхом приєднання до карбоксильної частини G-білка везикулярного стоматиту сигнальної послідовності, що визначає транспорт в матрикс. Гібридний білок імпортувався в мітохондрію in и закреплялся во внутренней мембране с помощью трансмембранного домена G -белка. vitro і закріплювався у внутрішній мембрані за допомогою трансмембранного домену G-білка. -концевой последовательности, функционирующий как стоп-сигнал переноса во внутреннюю, но не в наружную мембрану, содержится также в ADP / ATP -переносчике. Сегмент N-кінцевий послідовності, що функціонує як стоп-сигнал перенесення у внутрішню, але не в зовнішню мембрану, міститься також у ADP / ATP-переносника.

Сигнальні послідовності в хлоропластах

Первинні сигнали сортування хлоропластних білків, закоді-ванних в ядрі, схожі з сигналами, характерними для мітохондрій-альних білків. Так, було показано, що препоследовательность одного з хлоропластних білків направляє білки-пасажири в мітохондрії дріжджів. Який механізм сортування білків з різних органел при наявності як хлоропла-стів, так і мітохондрій - неясно. Сортування білків хлоропла-стів в самій органелле є навіть більш складною проблемою, ніж у випадку мітохондрій. Хлоропластних білки можуть перебувати в будь-який з двох мембран оболонки або в стромі, вони можуть вбудовуватися в мембранах тилакоїдів або перетинати її, проникаючи в порожнину тилакоїди. -концеЕой препоследовательности в группах из отдельных доменов аналогично митохондриальным сигналам сортировки. Вторинні сигнали, мабуть, локалізовані всередині N-концеЕой препоследовательності в групах з окремих доменів аналогічно мітохондріальних сигналам сортування. Таким чином, для того щоб білки, закодовані у ядрі, могли потрапити в порожнину тилакоїди, необхідні принаймні два сигнали: один для проходження білка через оболонку з подальшим утворенням розчинної попередника в стромі і другий для транспорту через мембрану тилакоїди.

Структурні особливості послідовностей, відповідальних за направлення білків в матрикс

При порівнянні сигнальних послідовностей, відповідальних за транспорт білків у мітохондрії, виявляється не якась специфічна послідовність, а швидше загальна тенденція цих сигналів до утворення позитивно заряджених амфіфільних спіралей. Як правило, ці послідовності взагалі не несуть негативних зарядів або слабо заряджені, причому лізіновие н аргінінових залишки розташовані таким чином, що при формуванні а-спіралі вони виявляються в основному на одній з її сторін, утворюючи область з чітко вираженими гідрофобними властивостями. Такі амфіфільні послідовності дуже часто зустрічаються в розчинних білках. , будучи присоединенными к белку-пассажиру, инициируют транспорт этого белка в митохондрию. Показано, що внутрішні послідовності з цитозольного ферменту дигідрофолат-редуктази, а також послідовності, утворені випадковим чином з генома Є. coli, будучи приєднаними до білка-пасажирові, ініціюють транспорт цього білка в мітохондрії. Роль таких сигналів можуть грати багато штучних послідовності. Цікаво відзначити схожість між сигналом, відповідальним за транспорт білка в мітохондрії, і передбачуваної амфіфільних спіраллю, яка, мабуть, утворює «датчик напруги» в іонних каналах. Очевидно, що для впізнавання рецепторів, що беруть участь в імпорті в мітохондрії, істотні швидше деякі особливості вторинної структури, ніж наявність характерних амінокислотних залишків. - A 2. Як ми вже говорили, хорошу модель рецептора, здатного пов'язувати безліч різноманітних пептидів, представляє антиген гістосумісності HLA - A 2.

Показано, що синтезовані хімічним способом пептиди, що відповідають мітохондріальних сигнальним послідовностей, зв'язуються з ліпідними бі-і моношарами і утворюють спіраль в присутності деяких фосфоліпідів і детергентів. Крім того, один із синтезованих пептидів блокує імпорт попередників мітохондріальних білків, можливо зв'язуючись зі специфічними рецепторами. Вважають, що сигнальна послідовність спочатку викликає концентрування попередника в мембранах, а потім зв'язування зі специфічним рецептором в зовнішній мембрані. Як видно з рис. 8, необхідною умовою зв'язування є наявність трансмембранного потенціалу на внутрішній мембрані. Виходячи із запропонованої моделі амфнфільний сигнальний пептид спочатку зв'язується з поверхнею мембрани, а потім просувається всередину її під дією різниці потенціалів. Така проміжна структура позитивно зарядженої спіралі, зануреної в мембрану, звичайно, нестабільна. Однак, якщо енергетичний бар'єр переходу в цей стан менше, ніж приблизно 18 ккал / моль, то пептид все-таки може перетинати мембрану з прийнятною швидкістю. Втім, це малоймовірно, особливо якщо врахувати високу щільність гідроксильованих амінокислот, зазвичай присутніх в препоследовательностях крім інших позитивно заряджених амінокислот. Згідно альтернативної моделі, трансмембранний потенціал впливає на рецепторні білки чи гаданий канал всередині мембрани, через який здійснюється перенесення. Відзначимо, що для перенесення в строму хлоропласта не потрібно наявності трансмембранного потенціалу, хоча сигнали, відповідальні за транспорт білків у ці органели, подібні.

6. СИГНАЛЬНІ пептидаз

-концевых сигнальных пептидов необходимы специфические белки. Для видалення тимчасових N-кінцевих сигнальних пептидів необхідні специфічні білки. . Большинство экспортируемых белков Е. coli Найбільш повно охарактеризовано сигнальні протеази з Є. coli. Більшість експортованих білків Є. coli містять сигнальний пептид, який відщеплюється на періплазматіческой поверхні внутрішньої мембрани за допомогою лідер-пептидази; її структура представлена ​​на рис. 10.12. Для перенесення білків через внутрішню мембрану ця пептідаза не потрібна, але вона необхідна для вивільнення експортованого білка з цитоплазматичної мембрани. In очищенный фермент мог функционировать, будучи включенным в липосомы. vitro очищений фермент міг функціонувати, будучи включеним в ліпосоми. Специфічність розщеплення вельми висока, але не визначається виключно амінокислотною послідовністю поблизу сайту розщеплення. , что неудивительно, если учесть сходство сигнальных последовательностей. Сигнальна пептідаза, яка функціонує в еідоплазматіческом ретикулумі, має ту ж специфічність, що й відповідний фермент Є. coli, що не дивно, якщо врахувати схожість сигнальних послідовностей. Була очищена сигнальна пептідаза з мікросом еукаріот. Показано, що вона асоційована з іншими поліпептидами, можливо мають відношення до механізму переносу.

У Е. coli є друга сигнальна пептідаза, що бере участь у процессингу проліпопротеінов. Ці поліпептидні компоненти оболонки Є. coli -конец модифицируется с помощью глицерида. чудові тим, що при дозріванні їх N-кінець модифікується за допомогою глицерида. Проліпопротеі-нова сигнальна пептідаза також знаходиться на цитоплазматичній мембрані. Після відщеплення сигнальний пептид залишається в цитоплазматичній мембрані і руйнується за допомогою мембрани носвязанного ферменту протеази IV.

У мітохондріях і хлоропластах повинно бути присутні кілька сигнальних пептидаз, оскільки процесинг відбувається більш ніж в одному компартменте. Розчинну пептидаз з мітохондріального матриксу вдалося частково очистити, але охарактеризована вона не повністю.

7. РОЗЧИННІ І мембранозв'язаних БІЛКИ, НЕОБХІДНІ ДЛЯ ПЕРЕНЕСЕННЯ

Ідентифіковано декілька цитозольних і мембранозв'язаних-них білкових компонентів, необхідних для перенесення. Найбільш детально охарактеризовано білкові фактори, які беруть участь у вбудовуванні білків в ендоплазматичний ретикулум ссавців.

- PHK . 1. Сигнал-розпізнає частинка. Це розчинний рн-бонуклеопротеіновий комплекс, що складається з шести різних білків і молекули 7 S - PHK. СРЧ необхідна для ініціації переносу. Вона пов'язується з сигнальною послідовністю утворюється поліпептиду під час його синтезу на рибосомі. Для препролактіна, наприклад, константа дисоціації становить 1 нМ. За допомогою методу фотохімічного зшивання був ідентифікований один з полнпептідов, безпосередньо взаємодіє із сигнальною послідовністю попередника. За деякими даними, отриманими для безклітинних систем, зв'язування СРЧ інгібує трансляцію або викликає її затримку. Втім, не виключено, що цей феномен є артефактом, в усякому разі, як було показано на модельних дослідах, його не обов'язково залучати до пояснення кінетики переносу білків in . vivo. Одна з вірогідних функцій СРЧ полягає в запобіганні неправильного згортання утворюється поліпептиду, яке може блокувати перенесення. Затримка трансляції повинна зменшувати ймовірність такого помилкового згортання і, отже, збільшувати ефективність переносу білків.

Деякі невеликі білки транспортуються в Ен-доплазматіческій ретикулум незалежно від СРЧ. лягушки, препромелиттин и пробелок оболочки фага М13. У їх число входять препропептід GLa жаби, препромеліттін і пробелок оболонки фага М13. У всіх цих прикладах конформація попередника така, що білки повинні залишатися здатними до перенесення навіть у відсутність СРЧ і рибосом.

2. Рецептор СРЧ, або стикувальний білок. Комплекс СРЧ / рибосома / утворюється поліпептидний ланцюг транспортується в шорсткий ендоплазматичний ретикулум, долаючи енергію сильної взаємодії між СРЧ і мембранозв'язаних рецептором СРЧ, званим також стикувальним білком. Рецептор СРЧ містить субодиницю з мовляв. -концом к мембране. масою 73 кДа, приєднану N-кінцем до мембрани. Ймовірно, рибосома також зв'язується зі специфічними рецепторами, присутніми в мембрані.

3. Рецептор сигнальної послідовності. Сигнальна послідовність на утворюється поліпептидного ланцюга переміщується від СРЧ до другого рецептору, що знаходиться в мембрані і званому рецептором сигнальної послідовності. Про це свідчать результати дослідів по фотохимическому зшивання, в яких використовується мітка, пов'язана з сигнальною послідовністю препролактіна. Передбачуваний мембранозв'язаних рецептор є глікопротеїн з мовляв. масою 35 кДа. Можливо, він становить частину каналу, через який здійснюється перенесення. За допомогою такого ж підходу з використанням поперечної зшивки і синтетичного сигнального пептиду був виявлений ще один кандидат на роль рецептора сигнальної послідовності. Зв'язок між цими двома білками невідома і функції їх до кінця не встановлені. Як тільки утворилася поліпептидний ланцюг зв'язується з мем-браносвязанним рецептором, СРЧ і її рецептор можуть звільнитися від рибосоми і взяти участь в новому циклі. Про передбачуваний каналі, що бере участь в перенесенні, нічого не відомо; очищення його є досить складним завданням.

Було показано, що для перенесення білків через ендоплазматичний ретикулум дріжджів необхідні розчинні фактори, проте їх схожість з СРЧ не встановлено. Перенесення різних секретується білків в дріжджах може відбуватися після завершення трансляції, тому не виключається, що в цих випадках утворюються поліпептидні ланцюги взаємодіють з мембрано-пов'язаним рецептором сигнальної послідовності. , а также для импорта белков в митохондрию, но охарактеризовать их не удалось. Мабуть, розчинні білкові фактори необхідні і для експорту білків в Є. coli, а також для імпорту білків в мітохондрії, але охарактеризувати їх не вдалося. , необходимый для экспорта белков в Е. coli , является мембраносвязанным, но его функция остается неизвестной. Було показано, що продукт гена secY, необхідний для експорту білків в Є. coli, є мембранозв'язаних, але його функція залишається невідомою.

Певні успіхи були досягнуті при ідентифікації рецептора на зовнішній мітохондріальній мембрані, необхідного для імпорту білків. / ATP -переносчика, белка внутренней мембраны. Досліди по зв'язуванню з поріном показали, що на мембрані є якийсь рецептор з високою спорідненістю, який бере участь в імпорті ADP / ATP-переносника, білка внутрішньої мембрани. Ідентифіковано два різних поліпептиду - компонента рецептора сигнальної послідовності зовнішньої мембрани. При цьому використовувалися два методи: блокування імпорту білків ан-очисники та хімічна зшивання з синтетичним сигнальним пептидом. Цікаво, що імпорт в мітохондрії, мабуть, не пов'язаний з зовнішньою мембраною, яка видаляється при утворенні мітопластов. Це спостереження дозволяє припустимо

жити, що інший рецептор сигнальної послідовності знаходиться у внутрішній мембрані.

8. ЗБІРКА МУЛЬТІСУБ'ЕДІНІЧНИХ КОМПЛЕКСІВ І ОНОВЛЕННЯ МЕМБРАННИЗ БІЛКІВ

Після вбудовування мембранного поліпептиду в мембрану він ще повинен придбати правильну конформацію, що забезпечує його біологічну активність, а якщо мова йде про мультнсуб'-одиничних комплексах, то зв'язатися з іншими білками. Зокрема, у еукаріотів при цьому повинні відбутися різні ковалент-ні модифікації, наприклад глікозилювання, ацилювання, сульфування або освіту днсульфідних зв'язків. Навіть коли такі модифікації не є необхідними, процес конформаційно-ного дозрівання може бути повільним і відстояти за часом від вбудовування в мембрану.

Наприклад, у Є. coli и OmpF , после включения соответствующих мономеров в наружную мембрану, при этом созревание LamB занимает около 5 мин. чітко спостерігається збірка стабільних три-мірів обох білків, LamB і OmpF, після включення відповідних мономерів в зовнішню мембрану, при цьому дозрівання LamB займає близько 5 хв. У еукаріотнческіх клітинах гли-копротеін гемагглютннііа вірусу грипу, перш ніж потрапити з ендоплазматичного ретикулума в комплекс Гольджі, повинен сформувати правильну четвертинну структуру, відповідну зрілої формі. Несверіутие молекули гемаглютиніну залишаються в ЕПР. Освіта тримерів займає приблизно 7-10 ми Академії. -белка вируса везикулярного стоматита. Схожа олігомеризація спостерігається також для G-білка вірусу везикулярного стоматиту.

Збірка багатьох мультісуб'едінічних комплексів, що містять різні субодиниці, теж, мабуть, відбувається в ЕПР. Прикладом служить нікотиновий ацетілхо-линів рецептор, який містить дві а-субодиниці і по одній / 3 -, у-і б-субодиниці. За допомогою антитіл можна розрізнити окремі форми а-субодиниці: 1) початковий продукт, вбудовується в ендоплазматичний ретикулум; ця форма не може пов'язувати антагоніст а-бунгаротоксін; 2) форма, здатна зв'язуватися з а-бунгаротоксіном і що настає через кілька хвилин після завершення трансляції в ЕПР; 3) зріла рецептор, що містить всі субодиниці, який виявляється через 15 хв після завершення трансляції в ЕПР; 4) готовий рецептор на клітинній поверхні, що з'являється через приблизно 2 години після трансляції. Дозрівання включає освіту днсульфідних зв'язків, олігосахаридних процесинг і ацилювання за участю жирних кислот. Ймовірно, певну роль в збірці, яка відбувається у комплексі Гольджі, грає фосфорилювання субодиниць.

Вирішальним чинником процесу складання є, ймовірно, стабільність таких стехіометричних комплексів, як ацетилхолін-вий рецептор. Мабуть, у деяких системах окремі субодиниці синтезуються в значному надлишку і не утворюють стабільних комплексів, а піддаються протеолитическому розщеплення. Про це свідчать результати, отримані при вивченні деяких мультісуб'едііічних комплексів, зокрема Т-клітинного рецептора антигену.

-канал. Вивчався також процес дозрівання і збирання структури, що утворює Na-канал. Необхідною умовою дозрівання є утворення дисульфідній зв'язку між а-і / Зг-субодиницями, однак ця подія відбувається через приблизно 1 год після трансляції і транспорту субодиниць в апарат Гольджі, а рецептор з'являється на клітинній поверхні чере:> 4 год після трансляції. У цьому випадку вільні а-суб'едіннци не піддаються швидкої деградації, а зберігаються в міжклітинному пулі і, можливо, використовуються надалі як попередників для формування каналу в зростаючих нейронах.

Дозрілі мембранні білки піддаються безперервного оновлення. -канала составляет около 30 ч , что типично для поверхностных белков. Період полуобновленія Na-каналу складає близько 30 год, що типово для поверхневих білків. / K -АТРазы в растущих клетках в культуре происходит за время 20 — 40 ч. По-видимому, деградация по крайней мере некоторых белков происходит в лизосомах. Оновлення великої субодиниці Na / K-АТРази у зростаючих клітинах в культурі відбувається за час 20 - 40 ч. Мабуть, деградація принаймні деяких білків відбувається в лізосомах. Як приклад можна навести цитохром Р450, що міститься в ЕПР.

Два цікаві приклади поновлення мембранних білків

Стабільність білків у клітині визначається безліччю різних факторів. Особливо цікавим прикладом деградації мембранних білків є гідроксиметилглутарил-СоА-редуктаза. Цей фермент знаходиться в гладкому ЕПР і регулює ендогенний синтез холестери-ла. Деградація його відбувається досить швидко і прискорюється при взаємодії з холестеролом. Для прискорення процесу необхідна наявність мембранозв'язаних домену ферменту. За певних умов у культурі ооцитів китайського хом'ячка спостерігається сверхпродукція цього ферменту. У результаті утворюються мембранні трубочки, що займають 15% клітинного об'єму і містять інші мембранні білки, а також ліпіди. Додавання холестеролу призводить до швидкої деградації надлишку мембран, що говорить про координацію синтезу і деградації мембранних компонентів.

Іншим цікавим прикладом селективного метаболізму мембранних білків є гербіцідсвязивающій білок з мовляв. масою 32 кДа з тилакоїдів хлоропластів. Цей білок синтезується як попередник, дозріваючи всередині окремих ламелл тілнкоіда, не зібраних в грани, і є частиною фотосистеми II в ламелами, що входять до грани. На світлі швидкість деградації цього поліпептиду в мембрані набагато вище, ніж інших білків. Причина цього явища невідома, можливо , воно пов'язане з тим, що у фотосистемі II на світлі відбуваються якісь пошкодження.

9. Біосинтез і розподіл мембранних ліпідів

У мембранах еукаріотичних клітин виявлена ​​величезна кількість різних ліпідів, причому вони не розподілені рівномірно по різних клітинних мембран. Ця нерівномірність відноситься до розподілу як полярних головок, так і ацильних хвостів. Наприклад, ступінь ненасичені ™ фосфоліпідів у загальному випадку зменшується при переході від ендоплазматичного ретикулума до комплексу Гольджі і потім до плазматичної мембрани. Для тваринної клітини середнє молярне ставлення холестерол / фосфоліпіди дорівнює 0, 3 - 0,4, при цьому для плазматичної мембрани воно набагато вище, ніж для інших мембран, таких, як шорсткий ендоп-лазматіческій ретикулум. Крім того, для багатьох мембран характерно нерівномірний розподіл ліпідів і з різних половин бішару.

Питання про механізм створення й підтримки такої асиметрії дуже цікавий і складний. Нагадаємо, що багато мембрани еукаріотичних клітин беруть участь у ендоцитозу і екзоцитозу, при яких від одних мембран везикули відокремлюються, а з іншими зливаються. Цей процес селективен для білків, які транспортуються за допомогою везикул, але чомусь не призводить до ідентичності ліпідного складу тих, хто в нього мембран. Причина цього явища невідома, з'ясовані лише деякі його аспекти. Розглянемо, де синтезуються мембранні ліпіди, а потім обговоримо, як вони можуть транспортуватися до місця призначення.

10. Де синтезується МЕМБРАННІ ЛІПІДИ?

Прокаріоти

У Е. coli весь синтез фосфоліпідів протікає в плазматичній мембрані. У загальних рисах цей процес представлений на рис. 10.16. -диацилглицерола. Два ацилирующих фермента проявляют предпочтение к ненасыщенным жирнокислотным группам, находящимся в положении sn -2. На уровне CDP - диацилглицерола происходит разветвление процесса, после чего образуется фосфатидилсерин или фосфатидилглицерол. Жирні кислоти синтезуються у вигляді попередників, ковалеітно пов'язаних з білком - переносником аціла, а згодом включаються в мембрану шляхом ацилювання з утворенням CDP-диацилглицерол. Два ацилюється ферменту виявляють перевагу до ненасичених жирнокислотним групам, що перебувають в положенні sn -2. На рівні CDP - диацилглицерол відбувається розгалуження процесу, після чого утворюється фосфатидилсерин або фосфатіділгліцерол.

Механізм регуляції рівноважного співвідношення між фосфоліпі-дами майже не вивчений. У штамах, в яких фермент, необхідний для біосинтезу кардіоліпіну, синтезується в кількостях, в 10 разів перевищують норму, спостерігається лише незначне збільшення вмісту цього фосфолипида в мембрані. Аналогічні результати були отримані для фосфатіділсерінсінтази і фосфатидилглицеролфосфатсинтазы. Сверхпродукція цих ферментів надає лише невеликий вплив на фосфоліпідний склад мембрани. З іншого боку, повна відсутність фосфатіділгліцеролфосфат-синтази згубно для клітини, ймовірно, тому, що кислі фос-фоліпіди необхідні для забезпечення попередниками інших біосинтетичних реакцій або беруть участь у регуляції. Отримано мутанти, що містять дуже мало фосфатіділгліцеролфос-фатсінтази, у яких єдиним основним фосфоліпіди є фосфатидилетаноламін. -диглицеридсинтаза и фосфатидилсеринсинтаза. Очищено деякі ферменти биосинтетического шляху, в тому числі CDP-дігліцерідсінтаза і фосфатіділсерінсінтаза. . Перший фермент, як і очікувалося, пов'язаний з мембранами, але фосфатіділсерінсінтаза пов'язана з рибосомами в безклітинних екстрактах Є. coli.

Еукаріоти

На рис. 10.17 представлена ​​складніша сумарна схема біосинтезу фосфоліпідів в еукаріотичних клітинах. Синтез жирних кислот відбувається як у ЕПР, так і в мітохондріях. Як субстрат використовується ацил-СоА, оскільки тварини клітини не містять еквівалента білку - переносники аціла. Більшість ферментів, які беруть участь у біосинтезі фосфоліпідів, локалізовано на цитоплазматичній стороні мембрани ендоплазматичного ретикулуму, але є і виключення. , синтез фосфатидилглицерола и кардиолипина может осуществляться через промежуточное образование CDP -диацилглицерола. В еукаріотичних клітинах, як і в Є. coli, синтез фосфатіділгліцерола і кардіоліпіну може здійснюватися через проміжне утворення CDP-диацилглицерол. Однак ферменти, необхідні для цього, містяться у внутрішній мембрані мітохондрій, і ці фосфоліпіди виявляються тільки в мітохондріях. , но соответствующий фермент обнаружен как в эндоплазматическом ретикулуме, так и в митохондриях. Нижчі еукаріоти теж можуть синтезувати фосфат-ділсерін за допомогою механізму, використовуваного Є. coli, але відповідний фермент виявлений як в ЕПР, так і в мітохондріях. У дріжджах на частку фосфатидил-серину доводиться тільки близько 5% всіх фосфоліпідів, але він є попередником фосфатидилетаноламін і фосфатіднл-холіну.

Еукаріоти, в тому числі і дріжджі, можуть синтезувати фосфо-тіділетаноламін і фосфатидилхолін в ході реакції з участю 1,2-днацілгліцерола. Це основний шлях синтезу фос-фоліпідов в тваринних клітинах. Потім спеціальні ферменти, що знаходяться в еідоплазматіческом ретикулуме вищих еука-ріот, каталізують реакцію обміну полярних головок, в результаті чого утворюється фосфат Іділ серії. Ця реакція необхідна вищим еукаріотів для отримання фосфатіділсерііа. Після утворення в еідоплазматіческом ретикулуме фосфат Іділ-серії декарбоксилуєтся до фосфатидил етанол аміну. Фермент, що каталізує цю реакцію, фосфат Іділ серіндека рбоксіл аз а, знаходиться в мітохондріях. Отже, фосфатидилсерин може бути головним попередником фосфатидилетаноламін в клітці. Для здійснення цієї послідовності реакцій повинен відбуватися перенесення ліпідів між ендоплазматичним ретикулумом і мітохондрій. Фосфатидилетаноламін може перетворюватися на фосфат-ділхолін за допомогою однієї або двох метилаза, що містяться в ЕПР, але цей шлях зазвичай не є головним.

Двома ліпідними компонентами, які локалізуються в основному в плазматичної мембрани, є сфінгоміелін і холестерол. Мабуть, сфінгоміелін утворюється в деяких клітинах шляхом переносу фосфатіділхоліновой групи від фосфат-ділхоліна на церамід за допомогою якогось ферменту, присутнього в плазматичній мембрані. Навпаки, незважаючи на те, що холестерол концентрується в основному в плазматичної мембрани, він синтезується за участю ферментів, що містяться в гладкому ЕПР і, можливо, в пероксисом-мах.

11. ТРАНСПОРТ ЛІПІДІВ ВІД МІСЦЯ ЇХ СИНТЕЗУ

Перенесення мембранних ліпідів від місця їх синтезу до місця призначення здійснюється за допомогою двох процесів: 1) трансмембранного фліп-флоп-переходу; 2) внутрімембранного транспорту. Швидкість фліп-флоп-переходу фосфоліпідів особливо велика для тих мембран, в яких відбувається біосинтез ліпідів; її характерний час складає величину порядку декількох хвилин. Є дані про те, що цей процес здійснюється за участю білків і, можливо, вимагає гідролізу АТР. Було також показано, що холестерол здатний до швидкого спонтанного фліп-флоп-переходу. Отже, транспорт через мембрану ендоплазматичного ретикулуму з цитозолю в просвіт відбувається досить швидко.

У транспорті ліпідів від однієї клітинної мембрани до іншої беруть участь кілька процесів. У різних випадках найбільш важливим може виявитися якийсь один з них.

  1. Самовільний перенесення ліпідів шляхом дифузії мономерних ліпідних одиниць через водну фазу.

  2. Дифузія ліпідів через постійні чи тимчасові місця з'єднання двох контактуючих мембран.

  3. Транспорт за участю білків, що каталізується, білками, що полегшують вивільнення ліпідів з донорної мембрани, або ліпідсвязивающімі білками.

  4. Транспорт за участю везикул, при якому ліпіди, як і мембранні білки, транспортуються в ході безперервного отпо-

чковиванія і злиття з мембранами внутрішньоклітинних везикул. Цей процес може бути енергозавнсімим.

Розглянемо спочатку, що відомо про мимовільної дифузії мембранних ліпідів між мембранами. Як показують численні дослідження, ліпіди можуть мимоволі переміщатися між моноламелляріимі везикулами або між фосфоліпідних везикулами і біомембранамн. У більшості випадків при цьому відбувається десорбція мономери ліпідів з поверхні донорной мембрани і вільна дифузія через водну середу до акцепторної мембрані. Лімітуючим етапом є вивільнення ліпідів з донорної мембрани. У цих умовах характерний час перенесення залежить від величини вільної енергії десорбції. Ясно, що менш водорозчинні ліпіди повинні долати при десорбції більш високий енергетичний бар'єр, а отже, їх перенесення повинен здійснюватися повільніше. Швидкість перенесення залежить не тільки від гідрофобності стерпного ліпнда, але і від складу і фізичного стану донорного бішару. находясь в фосфатидилхолиновых везикулах, существует в монодисперсном состоянии. Наприклад, гангліозид GM b перебуваючи в фосфатіділхолінових везикулах, існує в Монодисперсні стані. Завдяки наявності гідрофільних полярних груп він не робить фліп-флоп-переходів через мембрану везикул, але характерний час її перенесення везикулами становить близько 40 год при 45 ° С. Навпаки, нейтральні гангліозид, позбавлені залишків сиаловой кислоти, утворюють у везикулах гелеподібний кластер, і характерний час їх перенесення становить близько 500 ч. Суміш холестери-ла і фосфоліпідів у везикулах теж утворює складні фази, і це може впливати на кінетику перенесення холестеролу. Стабілізація холестеролу в мембрані могла б відбуватися за рахунок сприятливих взаємодій зі специфічними фосфо-ліпідами, наприклад зі сфінгоміелін.

У табл. 10.2 наведено характерні часи перенесення деяких мембранних ліпідів. На одному кінці шкали знаходяться ЕФД-ри холестеролу, які є у вищій мірі неполярними і не переносяться між мембранами за допомогою дифузії мономерів. На іншому кінці - лізофосфоліпіди, дуже швидко мігруючі між мембранами. Зазвичай характерний час перенесення холестеролу становить 1 - 2 ч. Таким чином, виникає питання, як підтримується унікальне розподіл ліпідів у різних мембранах.

Перенесення новосинтезованих холестеролу з ендоплазматіче-ського ретикулума в плазматичну мембрану здійснюється всього за 10 хв. На процес впливають агенти, що блокують біоенергетичні реакції в клітині, наприклад ціанід. Ці та інші дані свідчать про те, що внутрішньоклітинний транспорт холестеролу є енерогозавісімим процесом і протікає за участю везикул. У принципі він може переважити будь спонтанний перенесення. Проте єдиної думки з цього приводу не вироблено. Серйозною проблемою є те, що оцінки частки холестеролу, присутнього в плазматичній мембрані, від загальної його кількості в клітці сильно варіюють. На перший погляд здається, що кількість холестеролу, що надходить до деяких клітини і виходить із них, можна оцінити, використовуючи дані про швидкість мимовільної дифузії мономерів, проте неясно, чи придатні в даному випадку механізм спонтанного перенесення і зазначені швидкості.

Характерне час перенесення фосфоліпідів з фосфоліпідних везикул набагато більше, ніж холестеролу. Наприклад, для дипальмитоилфосфатидилхолина воно становить 83 год при 37 ° у випадку везикул з димиристоилфосфатидилхолина. Швидкість перенесення фосфоліпідів за допомогою цього механізму дуже мала, щоб відповідати реальним швидкостям міжмембранну транспорту.

Прокаріоти

Зупинимося спочатку на перенесенні фосфоліпідів у разі грам-негативних бактерій. Це відносно проста система, оскільки в ній є тільки дві мембрани. Фосфоліпіди синтезуються в плазматичної мембрани і повинні транспортуватися в зовнішню мембрану. Є дані про те, що між цими мембранами здійснюється швидкий обмін ли-п ідамі. Так, фосфатидил етанол амін досягає зовнішньої мембрани за характерний час ~ 3 хв. У цьому процесі не беруть участь білки, ліпіди або АТР, в.о. ої якимось чином залежить від протондвіжущей сили. . Таким образом, процесс, по-видимому, не является специфическим. Ліпіди, упровадилися в зовнішню мембрану, можуть також швидко переміщатися до внутрішньої мембрані, це відноситься навіть до фосфатидилхоліну, який в нормі не виявляється в Є. coli. Таким чином, процес, мабуть, не є специфічним. Тим не менш у мутантів штаму з дефектною діацілглнцеролкіназой диацилглицерол накопичується в плазматичної мембрани і до зовнішньої мембрани не транспортується.

Механізм ліпідів обміну між цими двома мембранами невідомий, але зазвичай вважають, що внутрішня і зовнішня мембрани мають місця з'єднання або області адгезії. Мабуть, саме через ці ділянки і відбувається дифузія ліпідів. Тут же можуть концентруватися білки, що експортуються до зовнішньої мембрани.

Еукаріоти

Механізм розподілу фосфоліпідів в еукаріотичних клітинах набагато більш складний. Єдиним фосфоліпідів, який локалізується виключно в місці свого синтезу, в мітохондрії, є кардіоліпін. Як показують численні експерименти, внутрішньоклітинний транспорт фосфоліпідів здійснюється значно швидше, ніж якщо б він визначався мимовільної дифузією у водному середовищі. Наприклад, перенесення новосинтезованих фосфолипида від ендоплазматичного рети-Кулум до мітохондрій в клітинах печінки щура відбувається всього за кілька хвилин. Оскільки декарбоксилази, що каталізує перетворення фосфатидилсерин в фосфатидилетаноламін, міститься в мітохондріях, дані про швидкість цієї реакції можуть використовуватися для контролю за перенесенням фосфатидилсерин з ендоплазматичного ретикулума в мітохондрії. Показано, що швидкість перенесення дуже висока, і процес інгібується азидом і агентами, блокуючими біоенергетичні реакції. Виявлено також, що новосинтезованих фосфолипид протягом декількох хвилин транспортується до плазматичної мембрани, хоча швидкість перенесення дуже сильно залежить від самого ліпіду і типу клітини. У деяких випадках транспорт ліпідів блокується інгібіторами біоенергетичних реакцій і / або агентами, що руйнують цитоскелет. Загальноприйнято, що швидкість перенесення ліпідів вище швидкості дифузії.

Одним із способів, що дозволяють полегшити перенесення фосфоліпідів між мембранами, є участь у цьому процесі білків. Виділено цілий ряд водорозчинних білків, що беруть участь в міжмембранну перенесення фосфоліпідів in . vitro. Всі вони мають ліпідсвязивающіе ділянки і утворюють водорозчинні комплекси з фосфоліпідами. Ці білки полегшують обмін ліпідів «один до одного» між мембранами шляхом переносу мономерів. В одних випадках зв'язування ліпндов відбувається з високою специфічністю і спорідненістю, в інших спорідненість і специфічність відносно низькі. У принципі при низькому спорідненості здатність білка каталізувати перенесення ліпідів від однієї мембрани до іншої повинна підвищуватися, оскільки білок при цьому може повертатися до донорной мембрані, маючи незайнятий ліпідсвязивающнй ділянку. Білки, що переносять фосфоліпіди, були виділені не тільки з тварин клітин, а й з бактерій і клітин рослин. Очищено білки, що зв'язуються з гликолипидов і довголанцюгових жирними кислотами,

На жаль, функція білків, що переносять фосфоліпіди, до цих пір не продемонстрована in , поэтому неясно, играют ли они физиологическую роль во внутриклеточном переносе фосфолипидов. vivo, тому неясно, чи грають вони фізіологічну роль у внутрішньоклітинному перенесення фосфоліпідів. Не виключено, що це перенесення опосередковується везикулами, а можливо, функціонують обидва механізми.

Важливо зрозуміти, що так чи інакше розподіл фосфоліпідів серед різних клітинних мембран детермінується білками. Якщо розподіл ліпідів равновесно, то воно визначається спорідненістю білків, присутніх у різних мембранах, до ліпідів. Зсув у розподілі деяких ліпідів з-за взаємодії їх з білками може впливати на розподіл інших ліпідів, наприклад холестеролу. Якщо розподіл ліпідів нерівноважної, то ліпідний склад різних мембран буде визначатися швидкістю транспортування ліпідів до мембран і від них, але і в цьому випадку кінетика процесу залежатиме від участі в ньому певних білків.

12. ОНОВЛЕННЯ Фосфоліпіди

Дані про швидкість оновлення ліпідів дуже мізерні, відомо лише, що вона дуже велика. У тваринних клітинах половина всіх фосфоліпідів оновлюється протягом одного або двох клітинних поділів. Швидкість відновлення полярної і неполярної частин фосфоліпідної молекули неоднакова. Мабуть, це пов'язано з дією внелізосомних фосфоліпаз і ацілтрансфераз, які викликають перебудову внутрішньоклітинних фосфоліпідів in . situ. Сфінголіпіди розщеплюються в лізосомах, і коли процес їх деградації порушується, виникає патологічний стан. Наприклад, при хворобі Ниманна-Піка відбувається накопичення сфінго-мієліну через нестачу лізосомного ферменту сфннгоміелінази. Деградація глікосфінголіпндов in также происходит в лизосомах, как полагают, с участием белков, которые специфически связываются с определенными липидами и, вероятно, растворяют их. vivo також відбувається в лізосомах, як вважають, за участю білків, що специфічно зв'язуються з певними ліпідами і, ймовірно, розчиняють їх.

У Е. coli є принаймні 10 деградуючих ферментів, які можуть брати участь у процесі оновлення фосфоліпідів, однак про їх функції in известно немного. vivo відомо небагато. При експоненційному зростанні швидкість оновлення гліцерольного кістяка й жирнокислотних ланцюгів мала; мабуть, невелика і швидкість обміну ацильних груп. Однак оновлення гліцерил-фосфатної головки фосфатіділгліцерола відбувається надзвичайно швидко. Це пов'язано з використанням фосфатіділгліцерола в якості донора 5л-гліцерол-1-фосфату для синтезу олігосахаридів мембранного походження. Ці олігосахариди містяться в періплазматіческом просторі і відіграють роль у осмотичної адаптації організму. У ході реакції відбувається перетворення фос-фатіділгліцерола в диацилглицерол, який потім перетворюється за допомогою діацілглнцеролкінази в фосфатидний кислоту.

13. Зміни ліпідного складу мембран у відповідь на зміни умов навколишнього середовища

З усього сказаного ясно, що про механізм контролю ліпідного складу клітинних мембран відомо дуже мало. Одне з мінімальних вимог полягає в тому, що мембранні ліпіди повинні утворювати стабільний бішар, що знаходиться в рідкокристалічному стані. Механізми, що забезпечують зміна ліпідного складу мембран у відповідь на зміни умов навколишнього середовища, мають багато організми. Найкраще вивчений механізм теплової адаптації Є. coli.

  1. . Теплова адаптація Є. coli. При вирощуванні Є. coli в умовах низьких температур спостерігається зміна жірнокіс-лотна складу в бік більшого вмісту ненасичених жирних кислот. Це сприяє підтримці мембрани в текучому стані і дозволяє клітинам вижити при екстремальних температурах. Переважаючими залишками жирних кислот в Є. coli є пальмітоіл, пальмітолеіл та цис-ваксеноіл. При низьких температурах в бішар включається більше досваксеновой кислоти, а вміст пальмітолеіловой кислоти залишається постійним. Пов'язано це з функціонуванням одного з двох ферментів, які каталізують подовження жирнокислотних ланцюгів. При низьких температурах фермент 3-кетоацил-АСР-синтаза II більш активно перетворює пальмітолеіловую кислоту в дос-ваксеновую, збільшуючи пул ненасичених жнріих кислот, що включаються у фосфоліпіди.

  2. 3 зависит от давления. Адаптація до підвищення тиску. Жірнокнслотний складу барофільной морської бактерії NPT 3 залежить від тиску. При зміні тиску в мембранах може також відбуватися фазовий перехід, і ця адаптація, як і в попередньому випадку, дозволяє організму вижити. При підвищенні тиску вміст у мембранах ненасичених жирних кислот збільшується, і завдяки особливостям їх упаковки мембрана залишається в рідкокристалічному стані. Аналогічні результати були отримані при вивченні фосфоліпідів мітохондрій з клітин печінки глибоководних океанічних риб.

3. Дослідження Acholeplasma . Этот организм является микоплаэмой. laidlawii. Цей організм є мікоплаемой. У нього немає клітинної стінки, а є єдина плазматична мембрана. Ця особливість дуже цінна для лабораторних досліджень, оскільки в мембрану можуть включатися екзогенні жирні кислоти, які легко виділяти і вивчати. Основними ліпідними компонентами є монокглюкозілді-гліцериди і діглюкозілдігліцеріди. Через відмінності у розмірі полярної головки виділені МГДГ утворюють оборотну гексагональну фазу, а ДГДГ - стабільний бішар. . laidlawii Фазові властивості мембран A. Laidlawii залежать насамперед від співвідношення між МГДГ і ДГДГ. Ліпнд-ний склад визначали в умовах росту організму в присутності окремих жирних кислот і при різних температурах або в присутності таких агентів, як спирти і детергенти. У цих випадках пояснити адаптивну реакцію тільки за допомогою вязкостних властивостей не вдається, оскільки необхідно враховувати рівновагу між ламеллярной і неламеллярной фазами. Взагалі кажучи, аналіз можна проводити, грунтуючись на величині параметра упаковки ліпідів, оскільки від нього залежить фазовий стан суміші мембранних ліпідів. Механізми, за допомогою яких організм адаптується до мінливих умов навколишнього середовища шляхом зміни свого ліпідного складу, невідомі.

Резюме

Клітини еукаріот містять багато мембранних органел і безліч різних внутрішньоклітинних мембран, кожна з яких володіє унікальним білковим та ліпідним складом. Будь-який мембранний білок, інформація про синтез якого укладена в ядрі, повинен безпомилково доставлятися від місця синтезу на ріоо-сомі, що знаходиться в цитоплазмі, до місця призначення. Для цього використовується складна система сигнальних послідовностей, що містяться в будь-якій зрілій формі поліпептиду або попередника, а також рецептори всередині клітини, здатні ці сигнали розпізнавати. Деякі мембранні білки включаються в ліпідний бішар мимоволі, але в більшості випадків правильна збірка білку всередині клітинної мембрани є енергозалежною процесом, який здійснюється за допомогою спеціалізованого апарату. Мабуть, білки не можуть включитися в клітинну мембрану до тих пір, поки вони не набудуть частково розгорнуту конформацію. Розгортання білків або підтримання їх в розгорнутій конформацін, необхідної для перенесення, можливо, здійснюються за участю АТР і специфічних білків у цитоплазмі.

У еукаріотичної клітці більшість ліпідів синтезується в еідоплазматіческом ретикулуме, і щоб потрапити до місця призначення, вони повинні пройти через відповідні мембрани. Механізм транспорту ліпідів невідомий, можна лише припустити, що в ньому беруть участь везикули і білки, що зв'язують ліпіди. Спосіб підтримки ліпідного складу різних внутрішньоклітинних мембран теж не встановлено.

Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Реферат
338.5кб. | скачати


Схожі роботи:
Біохімія мембран
Склад мембран
Асиметрія мембран
Властивості збудливих мембран
Гемоглобін еритроцитарних мембран людини
Структура і склад біологічних мембран
Будова і основні властивості клітинних мембран
Динаміка біологічних мембран Рухливість білків і ліпідів
Клітинна поверхня рецептори Рециклювання мембран і передача сигналів
© Усі права захищені
написати до нас
Рейтинг@Mail.ru