Федеральне агентство з освіти
Пензенський державний педагогічний університет
ім. В. Г. Бєлінського
Факультет Природничо-географічний
Кафедра біохімії
БІЛКИ КЛІТИННОГО ЦИКЛУ у відділи мозку СУСЛИКА CITELLUS UNDULATUS На різних стадіях ГІБЕРНАЦІОННОГО ЦИКЛУ
Введення
Зимова сплячка представляє собою форму адаптації тварин до дії несприятливих умов проживання: низької температури навколишнього середовища, відсутності їжі і т.д. [6, 39, 4] витрачають всі рівні організації від біохімічного до поведінкового, і реалізуються генетичні програми, що запускаються при дії відповідних зовнішніх (вкорочення фотоперіоду, зниження температури, нестатку кормів і т.д.) і внутрішніх факторів (цірканнуальние ритми нейромедіаторів, пептидів і гормонів) [3, 32].
Стан глибокого сну у зімоспящіх тварин характеризується тим, що при переході в цей стан температура тіла знижується і часто сягає близьконульових значень. Спостерігається суттєве зниження частоти серцевих скорочень - приблизно з 250 до 8-10 ударів в 1 хв і зниження частоти дихання - з 150 до одного-менш дихальних циклів у 1 хв [5]. Відзначається зниження рівня метаболізму від 0,2 кал / (г · хв -1) при глибокого сну [1]. Показано, що загальне споживання енергії в сезон глибокого сну (включаючи періодичні регулярні виходи зі сплячки) у гібернірующіх тварин на 87% менше, ніж у активних [39]. Протягом гібернаціонного сезону спостерігаються періодичні виходи тварин зі стану сплячки з відповідним підвищенням рівня метаболізму і температури тіла [39]. Таким чином, гібернація ділиться на періоди сплячки (баута), які перериваються короткими (зазвичай 24 год або менше) періодами еутерміі.
Процеси занурення в сплячку і пробудження, а також тривалість баута контролюються центральною нервовою системою. Навіть під час глибокої зимової сплячки деякі відділи мозку зберігають досить високу активність. Так, в лімбічної системи (а саме в септума, гіпокампі, гіпоталамусі) спостерігається майже постійна ЕЕГ-активність протягом всього баута [10].
Проблема зимової сплячки має не тільки загальнобіологічий інтерес, але й привертає увагу з безпосередньо практичної точки зору: отримані фундаментальні дані можуть бути покладені в основу розробки методів створення гіпобіозу, керованого за допомогою природних механізмів, що надзвичайно важливо для клініки, коли потрібно підтримати організм більш- менш тривалий час в стані значно знижених фізіологічних функцій. Така регульована штучна гіпотермія, викликає лише помірно шкідливі ефекти, сприяє підвищенню стійкості організму до впливу ряду неблагоріятних чинників, перш за все тканинної гіпоксії, що часто супроводжує різних видів патологічних процесів, зокрема порушень кровообігу [3]. Результати дослідження нейрогенеза у ховрахів при зміні функціонального стану мозку під час гібернаціонного циклу в літературі відсутні, проте наявність його показано у птахів при зміні сезонів і настання весни. Ряд авторів розглядає гібернацію як модель ішемії мозку, при якій зниження кровотоку, доставки кисню і глюкози під час сплячки, а також подальша реоксигенації при виході зі сплячки не призводять до пошкодження та загибелі клітин. Проте для ряду ішемічних станів, пов'язаних з нейродегенерацію і загибеллю клітин мозку, показано збільшення інтенсивності нейрогенеза в постішеміческій період.
2, cdk 2, cdk 4, МСМ2) и не связанной с клеточным циклом циклинзависимой киназы cdk 5 в мозге сусликов Citellus undulatus на разных стадиях гибернационного цикла.
У зв'язку з цим, метою роботи стало дослідження експресії білків клітинного циклу (циклінів - А, В1, ціклінзавісімих кіназ-cdc 2, cdk 2, cdk 4, МСМ2) і не пов'язаної з клітинним циклом ціклінзавісімой кінази cdk 5 в мозку ховрахів Citellus undulatus на різних стадіях гібернаціонного циклу.Завдання:
Визначити експресію білків клітинного циклу:
A, Cln B1;
2, cdk 2, cdk 4;
2;
5, не связанной с клеточным циклом.
Виявити відмінності в експресії білків клітинного циклу на різних стадіях гібернаціонного циклу і при різній температурі тіла тварин.
Глава 1. Огляд літератури
1.1 Біохімічні зміни в тканинах при зимовій сплячці
Зимова сплячка (гібернація) - це закріплена в ході еволюції унікальна здатність до мінімалізації життєвих функцій організму, що дозволяє ряду видів ссавців протягом багатьох місяців переживати холод, без харчів, скорочення світлого періоду доби [5]. У Європі, Азії, Америці впадають у зимову сплячку майже всі види кажанів, їжаки і багато гризунів: соні, тушканчики, хом'яки, бурундуки, ховрахи і бабаки [6, 39].
Основою цього пристосування, мабуть, є вкрай різноманітні шляхи збереження енергетичного балансу організму при сезонних змінах у зовнішньому середовищі. Підраховано, що протягом зимової сплячки (7-8 міс.) Ховрахів економиться від 80-90% енергії, яка могла б бути витрачена на підтримку звичайного рівня метаболізму [34].
Зимова сплячка є переривчастим процесом і складається з баута. Баут сплячки складається з входу в гіпобіоз, перебування в торпидном стані і виходу з нього [39]. Кожен баут сплячки може тривати від декількох годин до декількох тижнів і залежить як від фізіологічних особливостей тварин, так і умов навколишнього середовища [37].
Температура тіла ссавців під час зимової сплячки знижується аж до 0 ° С. Зниження температури тіла приводить не тільки до часткової або повної втрати чутливості та рухової активності, але і придушення активності всіх функцій і систем організму: кровообігу, дихання, травлення, водно-сольового обміну, гормонального статусу, розмноження [37, 39]. Характерним для сплячки є різке уповільнення дихання, в той час як в активному стані тварина робить від декількох десятків до декількох сотень дихання на хвилину [6]. Вихід зі стану заціпеніння супроводжується різким посиленням дихання, швидкої реперфузією тканин, активацією ліполізу [36]. Відомо, що рівень споживання кисню відображає рівень метаболізму. Так під час пробудження за 2 години температура тіла підвищується з 0 ° С до 37 ° С, а споживання кисню збільшується в 50 разів [27, 36].
У гібернірующіх тварин сильно (більш ніж на 50%) збільшується маса тіла [34]. Відомо, що при глибокого сну жир ссавців стає основним енергетичним субстратом [12]. Рясні запаси жирової тканини забезпечують тваринам існування протягом тривалого часу [34].
Баута глибокого сну довше і глибше в середині зими. У періоди пробудження тварини розігріваються і прокидаються. Температура тіла приходить в норму [34, 35].
Пробудження ссавців відбувається або внаслідок зігрівання при підвищенні температури середовища, або при зниженні її нижче 0 ° С.
Швидкість пробудження різна, але зазвичай воно відбувається дуже швидко. Різко збільшується частота дихання і серцебиття. Підвищується інтенсивність окислювальних процесів в організмі, майже повністю витрачається запас глікогену печінки [6]. При пробудженні, у фазі підвищеного термогенеза, частота серцебиття досягає більше 400 уд / хв [9]. Провідна роль у регуляції зимової сплячки і періодичних пробуджень належить нервової та ендокринної систем [1]. У гібернірующіх тварин поряд з біохімічними спостерігаються і деякі морфологічні зміни у тканині мозку. Так, деревоподібні структури дендритів коротшають при зниженні температури тіла і швидко ростуть при її підвищенні; при впадінні в сплячку скорочується площа тіла нейрона [18, 19].
1.2 Клітинний цикл
У нормі клітинний цикл - це послідовність подій, що призводять до поділу вихідної клітини на дві дочірні. Його поділяють на чотири фази (або стадії): S фаза (у ній відбувається реплікація ДНК) і М фаза (фаза мітозу) розділені проміжками - це фази G1 і G2. Спочиваючі клітини знаходяться в G0 фазі [30].
Для нервових клітин ссавців показано, що повторний вступ клітини в клітинний цикл залежить від позаклітинних сигналів. и EGF , тромбин, сыворотка) и факторы дифференцировки (цитокины, стрессорные влияния на клетку – такие как ультрафиолетовое излучение, или повреждающие ДНК воздействия) [ 31 ] .
0) и запуск фазы G 1 обеспечивается так: митогенные стимулы активируют митоген-зависимые протеинкиназы (МАРК) и экспрессию циклина D ( CnD ) (рис. 1):
Вихід клітини з спочиваючого стану (фази G 0) і запуск фази G 1 забезпечується так: мітогенний стимули активують мітоген-залежні протеїнкінази (МАРК) і експресію циклін D (CnD) (рис. 1):Рис. 1. Схема клітинного циклу.
/ cdk 4 (или cdk 6), который обеспечивает переход клетки из фазы G 0 в фазу G 1.
Далі відбувається утворення комплексу CnD / cdk 4 (або cdk 6), який забезпечує перехід клітини з фази G 0 у фазу G 1. подавляется (воздействием МАРК, активированных, например, в результате клеточного стресса), то происходит остановка клеточного цикла на стадии G 1. Якщо в цей період експресія CnD пригнічується (впливом МАРК, активованих, наприклад, в результаті клітинного стресу), то відбувається зупинка клітинного циклу на стадії G 1. 1 в клетке появляется CnE (деактивация которого также приводит к остановке клеточного цикла в G 1 фазе). На початку фази G 1 в клітині з'являється CnE (деактивація якого також призводить до зупинки клітинного циклу в G 1 фазі). фазу, необходимо образование CnE / cdk 2 комплекса. Для здійснення переходу в наступну фазу циклу - S фазу, необхідна освіта CnE / cdk 2 комплекси. 1 фазе начинает экспрессироваться CnA ; и комплекс CnA / cdk 2 обеспечивает вступление клетки в следующую (после стадии S ) фазу G 2 клеточного цикла. У цій же G 1 фазі починає експресуватися CnA; і комплекс CnA / cdk 2 забезпечує вступ клітини в наступну (після стадії S) фазу G 2 клітинного циклу. влечет за собой остановку клеточного цикла в G 2. Недолік CnA тягне за собою зупинку клітинного циклу в G 2. CnB, присутній у клітці протягом всієї інтерфази, активується в самому кінці фази G2 і утворює комплекс з cdс2, необхідний для початку останньої стадії циклу - М фази. приводит к остановке клеточного цикла в фазе G 2 [ 12, 33 ]. Деактивація CnB призводить до зупинки клітинного циклу у фазі G 2 [12, 33].1.3 Ішемічний інсульт і нейрогенез
Ішемічний інсульт (інфаркт мозку) розвивається при значному зменшенні мозкового кровотоку. На стадії реперфузії, коли мозковий кровотік відновлюється, відбувається інтенсифікація окисного стресу, який характеризується як дисбаланс між продукцією активних форм кисню і ємністю антиоксидантного захисту. У результаті окислювального стресу відбувається пошкодження ліпідів, білків і нуклеїнових кислот і загибель клітин мозку за некротичного та / або апоптотичній типу.
Гібернація є унікальним фізіологічекім станом, при якому відбувається зниження метаболізму і температури тіла, щоб забезпечити виживання в період дефіциту їжі. Значна ступінь нейропротекции при глибокого сну обумовлюється комбінацією чинників, які грають важливу роль в захисті мозку від ушкодження при кардинальній зміні мозкового кровотоку під час сплячки і після пробудження. Адгезія нейтрофілів і інфільтрація макрофагів в місце пошкодження стимулюють цітотоксічекіе реакції при ішемії мозку. Лейкоцитопенія, зниження продукції антитіл і підвищення антиоксидантного захисту можуть захищати нейрони від ушкодження при глибокого сну.
. На моделях фокальної ішемії-реперфузії показано, що інгібування синтезу білка, яке також спостерігається при глибокого сну, має нейропротекторну дію [22].Відомо, що в мозку експериментальних тварин після ішемії посилюється нейрогенез, який частково компенсує нейродегенеративні зміни. Показано, що в моделях на гризунах інсульт, викликаний оклюзією середньої мозкової артерії (ОСМА), запускає посилений нейрогенез в ушкодженому стріатумі і непошкодженому гіпокампі молодих гризунів. В результаті експериментів на тваринах старшого віку було показано, що у молодих і старих щурів відбувається однакове збільшення числа новостворених нейронів стріатума після інсульту, не дивлячись на те що базальна проліферація клітин в субвентрикулярній зоні у старих щурів була знижена [2]. Навпаки, кількість новостворених після інсульту гранулярних клітин і базальний нейрогенез в субгранулярній зоні зубчастої звивини були нижче у старих тварин у порівнянні з молодими. Крім того, у старих щурів в зубчастій звивині була ослаблена здатність новостворених клітин диференціюватися в нейрони. Але, тим не менш, величина стріарного постінсультного нейрогенеза порівнянна у молодих і старих тварин, що вказує на функціонування цього механізму відновлення також і в літньому віці.
Таким чином, механізми нейропротекции при глибокого сну пов'язані з гіпотермією, лейкоцитопенія, зниженням синтезу білка, підвищенням антиоксидантного статусу клітин мозку і, мабуть, можуть включати в себе також і зміна проліферації клітин мозку ні тільки в напрямку утворення нових нейронів, як показано на моделях ішемічного пошкодження мозку, але і в проліферації ендотеліальних клітин судин мозку і клітин глії [24].
Глава 2. Матеріали і методи
2.1 Об'єкт дослідження
У роботі використовували відділи мозку дорослих ховрахів Citellus обоего пола массой 280-400 г, отловленных в Якутии. undulatus обох статей масою 280-400 г, виловлених в Якутії.
2.2 Умови глибокого сну
Тварин утримували в індивідуальних відділеннях, забезпечених термодатчиком, в умовах природного освітлення при вільному доступі до води та їжі. У середині жовтня ховрахів переносили в спеціальне приміщення, де вони впадали у сплячку при температурі повітря 4 ° С і знаходилися там до повного пробудження (середина квітня). Досліди проведені на 7 групах ховрахів, узятих у різні фази гібернаціонного циклу і на різних стадіях зниження і підвищення температури тіла:
=8) – бодрствующие активные в летний период (июнь) животные, контроль;
1 група (n = 8) - безсонні активні в літній період (червень) тварини, контроль;=7) – животные, входящие в спячку осенью при температуре тела +36 ˚С ;
2 група (n = 7) - тварини, що входять у сплячку восени при температурі тіла +36 ˚ С;=7) – животные, входящие в спячку осенью при температуре тела +10 ˚С ;
3 група (n = 7) - тварини, що входять у сплячку восени при температурі тіла +10 ˚ С;=10) – спящие животные (январь),середина баута;
4 група (n = 10) - сплячі тварини (січень), середина баута;=4) – спонтанно пробудившиеся животные, межбаутное бодрствование;
5 група (n = 4) - спонтанно прокинулися тварини, межбаутное неспання;=10) – животные, пробудившиеся весной при температуре тела +25 ˚С;
6 група (n = 10) - тварини, які прокинулися навесні при температурі тіла +25 ˚ С;=5) – животные, пробудившиеся весной при температуре тела +10 ˚С.
7 група (n = 5) - тварини, які прокинулися навесні при температурі тіла +10 ˚ С.Моделювання стану зимової сплячки у ховрахів здійснювали співробітники інституту Біофізики клітини РАН (Пущино-на-Оке).
2.3 Підготовка зразків тканин мозку для аналізу
С l и на льду выделяли кору больших полушарий, мозжечок, гиппокамп, гипоталамус и ствол мозга.
Мозок ховрахів виймали, охолоджували в крижаному ізотонічному розчині Na З l і на льоду виділяли кору великих півкуль, мозочок, гіпокамп, гіпоталамус і стовбур мозку. Зразки заморожувалися і зберігалися в рідкому азоті, а потім були люб'язно надані нам для аналізу провідним науковим співробітником інституту Біофізики клітини РАН (Пущино-на-Оке) д.б.н. Семенової Т.П.20мМ рН 7,4).
Тканини гомогенізували при 4 ° С в гомогенизаторе Поттера (1500 об / хв) протягом 15-20 сек в 5 обсягах буфера (HEPES 20мм рН 7,4). и 4°С. Потім гомогенат центрифугували 30 хв при 13000 g і 4 ° С. Отриманий супернатант аліквотіровалі, заморожували і використовували у подальших дослідженнях.2.4 Біохімічні методи дослідження
2.4.1 Визначення вмісту білка
Концентрацію білка визначали за методом Бредфорд [16]. -250 и инкубировали 15 мин при комнатной температуре.
До 10 мкл супернатанту в оптимальному розведенні додавали 500 мкл 0.01% розчину барвника Кумассі яскраво синього G -250 і инкубировали 15 хв при кімнатній температурі. Після цього вимірювали поглинання при 595 нм. Як калібрувального стандарту використовували бичачий сироватковий альбумін в діапазоні концентрацій 0,1-0,8 мг / мл. У цьому діапазоні концентрацій стандартного білка поглинання при 595 нм лінійно залежить від концентрації білка і тому всі проби, після попереднього експерименту, розводили до отримання оптичної щільності, відповідної лінійному ділянці у стандарту.2.4.2 Електрофорез у поліакриламідному гелі. Вестерн-блот
Електрофорез у ПАГГ застосовується для розділення білків за молекулярною масою під дією електричного струму. В якості стандартного зразка використовують білки-маркери з молекулярними масами 11-170 кДа.
АА; 1,875 мл 4х Tris / Cl / SDS pH =8,8; 3,125 мл Н 2 О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED ) и 3,9% концентрирующий (верхний) гель (0,65 мл 30% АА, 0,8% bis АА; 1,25 мл 4х Tris / Cl / SDS pH =6,8; 3,05 мл Н 2 О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED ) .
Для розділення досліджуваних білків використовувався 10% розділяє (нижній) гель (2,5 мл 30% АА, 0,8% bis АА; 1,875 мл 4х Tris / Cl / SDS pH = 8,8; 3,125 мл Н 2 О; 25 мкл 10% амонію персульфата; 5 мкл TEMED) і 3,9% концентрує (верхній) гель (0,65 мл 30% АА, 0,8% bis АА; 1,25 мл 4х Tris / Cl / SDS pH = 6,8 ; 3,05 мл Н 2 О; 25 мкл 10% амонію персульфата; 5 мкл TEMED)., кипятили 5 мин при 100°С и охлаждали до комнатной температуры.
Підготовка проб до електрофорез здійснювалася таким чином: до аліквотах супернатанту об'ємом 100 мкл додавали 20 мкл Sample buffer, кип'ятили 5 хв при 100 ° С і охолоджували до кімнатної температури. и комнатной температуре и отбирали супернатант, который перед нанесением на гель разводили таким образом, чтобы конечная концентрация белка в нём составляла 60 мкг на лунку геля. Після цього проби центрифугували 5 хв при 13000 g і кімнатній температурі і відбирали супернатант, який перед нанесенням на гель розводили таким чином, щоб кінцева концентрація білка в ньому становила 60 мкг на лунку гелю., содержащий 1% додецилсульфата натрия ( Tris , глицин, SDS )) 1-1,5ч при 200 V .
Електрофоретичне поділ досліджуваних білків проводилося в денатуруючих умовах (використовувався 1х Running buffer, що містить 1% додецилсульфату натрію (Tris, гліцин, SDS)) 1-1,5 год при 200 V. осуществлялся в Transfer buffer ( Tris , глицин,этиловый спирт) 45-60 мин при 150 m А,110 V . Перенесення білків з гелю на мембрану PVDF здійснювався в Transfer buffer (Tris, гліцин, етиловий спирт) 45-60 хв при 150 m А, 110 V.5
2.4.3 Виявлення білків клітинного циклу і ціклінзавісімой кінази Cdk 5(50 мМ Tris / Cl , pH =7,5; 0,9% NaCl ; 0,05% Tween 20), после чего инкубировали с различными разведениями специфических первичных антител в 5% молоке в TBST 2ч при комнатной температуре или 15-16ч при 4 0 С.
Плівку з перенесеними білками блокували протягом 15 - 16 год для запобігання неспецифічного зв'язування в 5% розчині знежиреного молока в TBST (50 мМ Tris / Cl, pH = 7,5; 0,9% NaCl; 0,05% Tween 20), після чого инкубировали з різними разведениями специфічних первинних антитіл в 5% молоці в TBST 2ч при кімнатній температурі або 15-16ч при 4 0 С. в течение 30 мин. Для видалення незв'язаних антитіл мембрану відмивали 4-х кратно в TBST протягом 30 хв. Зв'язавшись первинні антитіла виявляли за допомогою вторинних антитіл, отриманих в іншого виду тварин проти первинних, кон'югованих з пероксидазою хрону. Зв'язування антитіл візуалізували на рентгенівській плівці з використанням хемілюмінесцентний системи, яка в присутності пероксидази хрону окислюється з виділенням квантів світла.Детекцию білків проводили в оптимальних умовах, які були підібрані раніше.
Таблиця 1
Умови імунодетекції досліджуваних білків при Вестерн-блот аналізі.
Білок | 1 Ab | Розведення | 2Ab | Розведення |
MCM 2 | (козьи поликлональные) Goat polyclonal (козячі поліклональні) | 1:500 | - anti - Goat (кроличьи антикозьи) Rabbit - anti - Goat (кролячі антікозьі) | 1:2000 |
Cn B1 | (кроличьи поликлональные) Rabbit polyclonal (кролячі поліклональні) | 1:1000 | козьи Goat-anti-Rabbit (козячі антікролічьі) | 1:2000 |
Cn A | Rabbit polyclonal | 1:1000 | Goat-anti-Rabbit | 1:1000 |
Cdc 2 | Rabbit polyclonal | 1:1000 | - anti - Rabbit Goat - anti - Rabbit | 1:2000 |
Cdk 2 | Rabbit polyclonal | 1:500 | - anti - Rabbit Goat - anti - Rabbit | 1:2000 |
Cdk 4 | Rabbit polyclonal | 1:1000 | - anti - Rabbit Goat - anti - Rabbit | 1:2000 |
Cdk 5 | Rabbit polyclonal | 1:1000 | - anti - Rabbit Goat - anti - Rabbit | 1:2000 |
2.5 Статистична обробка результатів
7 с использованием t -критерия Стьюдента. Статистичний аналіз здійснювався за допомогою програми Statistica 7 з використанням t-критерію Стьюдента.
Різниця вважалося достовірним при рівні значущості Р <0,05.
Усі дослідження виконані в лабораторії функціональної біохімії нервової системи інституту Вищої нервової діяльності та нейрофізіології РАН.
Автор висловлює глибоку подяку за надану всебічну допомогу при виконанні роботи співробітникам лабораторії функціональної біохімії нервової системи інституту Вищої нервової діяльності та нейрофізіології РАН, окремо к.б.н. Онуфрієву Н.В. та д.б.н., професору Гуляєвої Н.В.
Глава 3. Отримані результати та їх обговорення
Експресія білків клітинного циклу і Cdk 5 має різний рівень у досліджених відділах мозку і залежить від функціонального стану ховрахів.
4, а экспрессия MCM 2 и Cdk 5 имеет лишь тенденции к снижению по сравнению с контролем (активные животные) (рис.2) . Гібернація достовірно знижує в гіпокампі рівень експресії Cdc 2, Cdk 2 і Cdk 4, а експресія MCM 2 і Cdk 5 має лише тенденції до зниження в порівнянні з контролем (активні тварини) (рис.2). Експресія циклінів. А та В1 залишається практично на тому ж рівні, що й у активних ховрахів. У спонтанно пробуджених тварин рівень експресії досліджуваних білків також істотно не змінювався порівняно з контролем. = 0,97 , p < 0,05). Проте на стадії пробудження при температурі + 25 ° С була виявлена позитивна кореляція між циклінів В1 та ЧСЧ 2 (r = 0,97, p <0,05). Можливо, на стадії пробудження при температурі + 25 ° С освіта МСМ 2 йде однонаправлено з біосинтезом Сn B1 на відміну від пробудження при температурі + 10 ° С (відомо, що комплекс МСМ 2/МСМ4 є субстратом для комплексу Cdc2/Cn B1 in vitro) . МСМ 2 є маркером реплікації ДНК, його рівень зростає при переході клітини з фази G1 у S фазу клітинного циклу. А циклін В1 активується в кінці фази G2, утворюючи комплекс з Cdc 2, небхідно для початку останньої стадії циклу - М фази (власне мітозу).
Рис. 2 Експресія досліджуваних білків у гіпокампі ховрахів CITELLUS UNDULATUS на різних стадіях гібернаціонного циклу
Відмінності від групи контрольних тварин: * - p <0,05; # - p <0,1.
У корі великих півкуль мозку на експресію білків впливала температура навколишнього середовища, при якій тварини знаходилися на стадіях входження в сплячку і виходу з неї (рис. 3). Cdc 2 и MCM 2 – внутри группы входа из спячки; циклина В1 – внутри группы вхождения в спячку. Так,по сравнению с контрольной группой животных на стадии пробуждения при +10 °С достоверно возрастал уровень экспрессии Cdc 2, MCM 2 и Cdk 4 . Достовірними є відмінності рівня експресії Cdk 5 і Cdk 4 усередині груп входження і виходу із сплячки; Cdc 2 і MCM 2 - всередині групи входу зі сплячки; циклін В1 - всередині групи входження в сплячку. Так, в порівнянні з контрольною групою тварин на стадії пробудження при +10 ° С достовірно зростав рівень експресії Cdc 2, MCM 2 і Cdk 4. °С достоверно снижалась экспрессия Cdk 4; на уровне тенденций экспрессия Cdc 2 снижалась, а циклина В1 и MCM 2 - повышалась. При +25 ° С достовірно знижувалася експресія Cdk 4; на рівні тенденцій експресія Cdc 2 знижувалася, а циклін В1 і MCM 2 - підвищувалася. °С достоверно возрастала экспрессия MCM 2 и Cdk 4,снижалась экспрессия Cdk 5 ; а при + 36 °С на уровне тенденций изменялась только экспрессия Cdk 4 (уменьшалась). При входженні в сплячку при +10 ° С достовірно зростала експресія MCM 2 і Cdk 4, знижувалася експресія Cdk 5; а при + 36 ° С на рівні тенденцій змінювалася тільки експресія Cdk 4 (зменшувалася).
У сплячих тварин порівняно з контрольною групою відмінностей в експресії досліджуваних білків не спостерігалося. 4, экспрессия Cdk 5 имела тенденцию к снижению. У межбаутний період достовірно зменшувалася експресія циклін В1 і збільшувалася експресія Cdk 4, експресія Cdk 5 мала тенденцію до зниження. циклином В1 ( r = - 0,98 , p < 0,05). У межбаутний період була виявлена негативна кореляція між Cdk 2 і циклінів В1 (r = - 0,98, p <0,05).
Рис. Экспрессия исследуемых белков в коре больших полушарий мозга сусликов CITELLUS UNDULATUS на разных стадиях гибернационного цикла 3 Експресія досліджуваних білків у корі великих півкуль мозку ховрахів CITELLUS UNDULATUS на різних стадіях гібернаціонного циклу
Відмінності від групи контрольних тварин: * - p <0,05; # - p <0,1.
У мозочку не спостерігається достовірних відмінностей всередині груп входження і виходу із сплячки при різних температурних режимах утримання тварин (рис. 4). Проте на стадії входження в сплячку (у порівнянні з контролем) спостерігається достовірне збільшення експресії Cdk 2 як при + 36 ° С, так і при + 10 ° С, а Cdk 4 - тільки при + 10 ° С. Експресія МСМ2 і циклін А збільшується на рівні тенденцій. Вихід зі сплячки при + 10 ° С супроводжується достовірним збільшенням експресії Cdc 2 і Cdk 2, а Cdk 4 і Cdk 5 - збільшенням на рівні тенденцій. При пробудженні при температурі +25 ° С тенденції до збільшення експресії мають циклін В1, МСМ2, Cdk 2, Cdk 4 і Cdk 5.
У сплячих тварин достовірно знижувалася експресія тільки Cdc 2.
Успонтанно пробуджених тварин достовірно зростала експресія тільки Cdk 4, а кількість інших білків коливалося на рівні контролю.
r = 0,97 , p < 0,05 ) на стадии вхождения в спячку при температуре + 10°С , отрицательная – на стадии пробуждения при температуре + 25°С между Cdk 2 и циклином А. Наверное различную роль играют Cdc 2 и циклин В1 на стадии вхождения в спячку, когда пролиферация снижается и при пробуждении, когда она более вероятна. Позитивна кореляція була виявлена між Cdc 2 і циклінів В1 (r = 0,97, p <0,05) на стадії входження в сплячку при температурі + 10 ° С, негативна - на стадії пробудження при температурі + 25 ° С між Cdk 2 і циклінів А. Напевно різну роль відіграють Cdc 2 і циклін В1 на стадії входження в сплячку, коли проліферація знижується і при пробудженні, коли вона більш вірогідна.
Экспрессия исследуемых белков мозжечке сусликов CITELLUS UNDULATUS на разных стадиях гибернационного цикла Рис.4 Експресія досліджуваних білків мозочку ховрахів CITELLUS UNDULATUS на різних стадіях гібернаціонного циклу
Відмінності від групи контрольних тварин: * - p <0,05; # - p <0,1.
У стовбурі мозку гібернація не викликала достовірних змін в експресії досліджуваних білків, тільки рівень МСМ2 мав тенденцію до збільшення.
У межбаутний період експресія білків змінювалася недостовірно.
+36˚С и при выходе из неё при температуре +25˚С, на уровне тенденции – при пробуждении при температуре +10˚С. Рівень експресії циклін А достовірно підвищувався при входженні в сплячку при температурі +36 ˚ С і при виході з неї при температурі +25 ˚ С, на рівні тенденції - при пробудженні при температурі +10 ˚ С. Вірогідним є відмінність в експресії Cdk 2 в групі виходу зі сплячки при різних температурних режимах (при температурі +25 ˚ С - зменшувалася, а при +10 ˚ С - збільшувалася). Відмінності спостерігаються лише всередині групи і відсутні при порівнянні з активними і межбаутнимі. Хоча при низькій температурі тіла під час виходу виходу зі сплячки експресія деяких білків в основному підвищується!
( r = -0,99 , p < 0,05) на стадии пробуждения при температуре +10˚С и между Cdk 2 и циклином В1 при вхождении в спячку при температуре +36˚С. Негативні кореляції були виявлені між Cdk 2 і циклінів А (r = -0,99, p <0,05) на стадії пробудження при температурі +10 ˚ С і між Cdk 2 і циклінів В1 при входженні в сплячку при температурі +36 ˚ С .
Рис. Экспрессия исследуемых белков стволе мозга сусликов CITELLUS UNDULATUS на разных стадиях гибернационного цикла 5 Експресія досліджуваних білків стовбурі мозку ховрахів CITELLUS UNDULATUS на різних стадіях гібернаціонного циклу
Відмінності від групи контрольних тварин: * - p <0,05; # - p <0,1.
Особливістю метаболізму мозку є інтенсивний окислювальний обмін. Основним субстратом енергетичного метаболізму мозку є глюкоза [14]. Клітини головного мозку утилізують 20% кисню, споживаного організмом, хоча сам мозок складає близько 2% від маси тіла [14, 17], що обумовлює потенційну можливість утворення великої кількості АФК у процесі окисного фосфорилювання. Ця обставина зумовлює потребу мозку у високому рівні кровопостачання.
У різні періоди гібернаціонного циклу істотно змінюється інтенсивність метаболічних процесів і інтенсивність енергетичного обміну в тканинах, у тому числі і головному мозку [35, 39]. Але саме провідна роль у функціональних нейрохімічних процесах в мозку належить безсумнівно білково - нуклеїнової метаболізму [3]. Протягом сплячки ховрахів спостерігається пригнічення синтезу білків у головному мозку і дуже різка активація утворення білків при намірі [4]. Тому можна очікувати, що рівень експресії білків клітинного циклу і Сdk 5 в різних відділах мозку буде залежати від фізіологічного стану тварин у період глибокого сну.
Ряд даних вказує на те, що при глибокого сну підвищується стійкість головного мозку до ушкоджувальних чинників. Наприклад, Фрера і Халенбек встановили, що зрізи гіпокампа у гібернірующіх 30-ти лінійних ховрахів мають підвищену толерантність до гіпоксії та аглікеміі [25]. Зої з співр. показали, що в стані зимової сплячки значно знижується в мозку викликаний ушкодженням окислювальний стрес [42].
При глибокого сну істотно змінюється ліпідний склад мембран клітин мозку [7]. Крім того, при переході ховрахів від неспання до сплячки відбувається латеральне поділ ліпідів мембран [15]. У результаті цього утворюються великі ліпідні області вмісту ненасичених жирних кислот, а білки накопичуються в окремі вузькі зони. Зміна ліпідного складу та їх упаковки при глибокого сну спрямоване на збереження структурної цілісності та функціональних властивостей мембран.
199, T 205, S 214, S 262, S 396, S 404). Останні дані показують, що в мозку гібернірующіх ховрахів пов'язаний з мікротубуліном білок tau гіперфосфорілірован по всіх шести сайтів (S 199, T 205, S 214, S 262, S 396, S 404). 199, S 262 и S 404) являются дефосфорилированными у пробуждающихся животных, что предполагает обратимое фосфорилирование указанных сайтов [ 28 ]. Цікаво, що тільки три з цих сайтів (S 199, S 262 і S 404) є дефосфорильованого у пробуджених тварин, що передбачає оборотне фосфорилювання вказаних сайтів [28]. У активних влітку ховрахів спостерігається найнижчий рівень рівень фосфорилювання. Відомо, що білок tau аномально гіперфосфорілірован в мозку особин з хворобою Альцгеймера та інших tau - патологій і, як припускають, грає важливу роль в патогенезі цих захворювань. А оскільки механізми, що приводять до аномальної фосфорилюванню tau залишаються неясними, то останні спостереження оборотного фосфорилування цього білка під час глибокого сну є ідеальною фізіологічної моделлю для вивчення даного процесу in vivo.
Висновки
Експресія білків клітинного циклу і Cdk 5 має різний рівень у досліджених відділах мозку і залежить від функціонального стану ховрахів.
Температура тіла ховрахів впливає на експресію білків клітинного циклу і Cdk 5 в корі великих півкуль і стовбурі мозку на стадіях входження в сплячку і виходу з неї.
Наявність кореляційних зв'язків між циклін та відповідними кіназами дозволяє припустити, що у відділах мозку ховрахів на стадіях входження в сплячку і виходу з неї з'являються клітини на пізніх фазах клітинного циклу.
Література
Бєлоусов А.Б. Роль центральної нервової системи в контролі зимової сплячки / / Усп. физиол. наук. - 1993. - Т. 24, № 2. - С. 109-126.
Дарзаліа В., Хелманом У., Ліндвалл О., Кока З. нейрогенез в старіючому головному мозку після інсульту / / Інсульт. - 2007, № 1.
Дьомін М.М., Шортанова Т.Х., Емірбеков Е.З. Нейрохімія зимової сплячки ссавців. Л.: Наука, 1988. -137 С.
Жегунов Г.Ф. , Микулинський Ю.Є. Активація синтезу білка в тканинах ховрахів при пробудженні після зимової сплячки / / Укр. биохим. журн. 1987. Т. 59, № 3. С. 69-73.
Ігнатьєв Д.А., Сухова Г.С. Сухов В.П. Аналіз змін частоти серцебиття і температури ховраха Citellus в различных физиологических состояниях // Общая биология – 2001. Undulatus в різних фізіологічних станах / / Загальна біологія - 2001. - Т. 62, № 1. - С. 66-77.
Калабухов Н.І. Сплячка ссавців. М.: Наука, 1985. - 259 с.
Коломійцева І.К., Перепьолкіна Н.І., Патрушев І.В., Попов В.І. при гибернации // Биохимия. Роль ліпідів в збірці ендоплазматичного ретикулуму та діктіосом якутського ховраха З itellus undulates при глибокого сну / / Біохімія. - 2003. - Т. 68, вип. 7. - С. 954-967.
Крепс Є.М. Ліпіди клітинних мембран. Л.: Наука, 1981. - С.339.
Соломонів Н.Р. Основні підсумки і завдання вивчення зимової сплячки гризунів Якутії / / Еколого-фізіологічні характеристики природних гіпометаболічний станів. - Пущино, 1992. - С. 29-34.
Штарк М.В. Мозок зімоспящіх. Новосибірськ: «Наука», 1970. - 240 c.
Шугалей Л.С. Молекулярні основи стійкості зімоспящіх тварин до несприятливих умов середовища / / Еколого-фізіологічні характеристики природних гіпометаболічний станів: Зб. наук. тр. / Под ред. Колаевой С.Г. - Пущино, 1992. - С. 70-73.
Емірбеков Е.З., Львова С.П., Клічханов Н.К. Біохімічні зміни в крові при штучній і природної гіпотермії / / Пробл. кріобіол. - 1995. - № 1. - С.14-21.
Емірбеков Е.З., Львова С.П., Мусаєв Б.С., Мейланов І.С., Сіммалавонг Сантісук, Бутаєва П.Ш., Абдулаєва М.З. Роль ліпідів мозку при гіпотермії і самозігрівання гомойотермних і зімоспящіх тварин / / Біохем. аспекти холодових адаптацій: Зб. наук. тр. - Харків, 1991. - С. 166-175.
Ames IA CNS energy metabolism as related to function / / Brain Research Rew. - 2000. - V. 34. - P. 42-68.
Azzam NA, Hallenbeck JM, Kachar B. Membrane changes during hibernation / / Nature. - 2000. - V. 407. - P. 317-318.
Bradford MM A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein using the principle of protein bindong / / Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.
Clarke DD, Sokoloff L. Circulation and energy metabolism of the brain / / Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Meducal Aspects. Sigel GJ, Agranoff BW, Alberts RW, Fisher SK, Uhler MD (Eds.) - Phyladelphia: Lippincott - Raven. - 1999. - P 637-669.
Christina G. von der Ohe, Craig C. Garner, Corinna Darian-Smith, H. Craig Heller. Synaptic Protein Dynamics in Hibernation. / / Neurosciens. - 2007 .- Nov 9; 149 (3).
Christina G. von der Ohe, Craig C. Garner, Corinna Darian-Smith, H. Craig Heller. Ubiquitos and Temperature - Dependent. / / Neurosciens. - 2008 .- Apr 9; 152 (4).
Copani Agata; Uberti Daniela; Sortino Maria Angela; Bruno Valeria; Nicoletti Ferdinando and Memo Mauritio. Activation of cell-cycle-associated proteins in neuronal death: a mandatory or dispensable path? Trends in Neuroscience. 2001 Jan; 24 (1): 25-31.
А .; Sortino MA; Nicoletti F. Copani А.; Sortino MA; Nicoletti F. and Stella Giuffrida AM Alzheimer's Disease Research Enters a "New Cycle": How Significant? / / Neurochemical Research. 2002 Feb; 27 (Nos. 1 / 2): 173-176.
Drew KL, Rice ME, Kuhn TB, Smith MA Neuroprotective adaptations in hibernation: therapentic implications for ischemia-reperfusion, traumatic brain injury and neurodegenerativedislases / / Free Radic. Biol. Med. - 2001. -V. 31. - P. 563-573.
Droge W. Free Radicals in the Physiological control of cell Function / / Physiol. Rev. - 2002. - V. 82. - P. 47-95.
Fang Zhou, Xiongwei Zhu, Rudy J. Castellani, Raphaela Stimmelmayr, George Perry, Mark A. Smith, and Kelly L. / / Drew Hibernation, a Model of Neuroprotection / / American Journal of Pathology, V. 158, No. 6, June 2001.
Frerichs KU, Kennedy C., Sokoloff L., Hallenbeck JM Local cerebral blood flow during hibernation, a model of natural tolerance to «cerebral ishemia» / / J Cereb Blood Flow Metab. - 1996. - V. 14. - P. 193-205.
Frerichs KU, Hallenbeck JM Hibernation in ground squirrels induces stats and species-specific tolerance to hypoxia and aglycemia: an in vitro study in hippocampal slices / / J. Cereb. Blood Flow. Metab. - 1998. - V. 18. - P. 168-175.
Hermes-Lima M., Zentenc-Sakin T. Animal response to drastic changes in oxygen akailability and physiological oxidative stress / / Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. - 2002. - V / 133 / - P. 537-556.
Jens Thorsten Stieler, Torsten Bullman, Franziska Kohl, Brian M. Barnes, Thomas Arendt. Physiological regulation of tau phosphorylation during hibernation. / / J Neural Transm. - 2009 (116): 345 - 350.
Р . Lipton Р. Ischemic cell death in brain neurons / / Physiol. Rev. - 1999. - V. 79. - P. 1431-1568.
Nagy Zs. Cell cycle regulatory failure in neurones: causes and concequences. Neurobiology of Aging. 2002 (21): 761-769.
Nagy Zs.; Esiri MM; Cato A.-M. and Smith AD Cell cycle markers in the hippocampus in Alzheimer's disease / / Acta Neuropathol. 1997 (94): 6-15.
Nurnberger F. The neuroendocrine system in hibernating mammals / / Cell and Tissue. Res. - 1995. - V. 28. - P. 391-412.
Ohnuma Shin-ichi; Philpott Anna and A Harris William. Cell cycle and cell fate in the nervous system. Current Opinion in Neurobiology. 2001 (11): 66-73.
Storey KB Turning down the fires of life: metabolic regulation of hibernation and estivation / / Mol. mech. metab. Arrest. - 2001. - P. 1-21.
Storey KB, Storey JM Metabolic rate depression in animals: transcriptional and translational controls / / Biol. Rev. Camp. Philos. Soc. - 2004. - V. 79. - P. 207-233.
Toien O., Drew KL, Chao ML, Rice ME Ascorbat dynamics ana oxygen consumption during arousal from hibernation in arctic ground squirrels / / Am. J. Physiol. - 2001. - V. 281. - P. 572-583.
Van Brenkelen F., Martin SL Reversible depression of transcription during hibernation / / J. Comp. . Physiol. ). (B). . - 2002 - V. 172. - P. 355-361.
Wang LCH Energetic and field aspects of mammalian torpor: the Richardson groundsquirrel / / Strategus in Cold: Natural Torpidity and Thermogenesis / / Eds LCH Wang, JW Hudson, NY: Acad. Press. - 1978. - P. 109-145.
Wang LCH, Lee TF Torpor and hibernation in mammals: metabolic, physiological, and biochemical adaptations / / Handbook of physiology: Oxford univer. Press., 1996. - № 4. - P. 507-531.
Yeh J., Tam CF, Catuirs E., Le TT, Papa V., Pena L., Vasquez M., Vu C., Wang S., Lopez GA Changes in karious plasms lipid components, glucose, and insulin in spermophilus lateralis during hibernation / / Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. - 1996. - V. 111. - P. 651-663.
Young JS, Woodside JV Antioxidants in health and disease / / J. Clin. . Pathol. . - 2001. V. 54. . - P. 1 76-186.
Zhou G., Zhu X., Castellani RJ, Stinnelmayr R., Perry G., Smith MA, Drew K. Hibernation, a model of neuroprotection / / Am. J. Pathol. - 2001. - V. 158. - P. 2145-2151.