Іонообмінна хроматографія

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

Реферат на тему:
Іонообмінної хроматографії

Рухома і нерухома фази
Переходячи до розгляду варіантів істинної хроматографії, корисно ввести поняття «рухомий» і «нерухомою» фаз. Мається на увазі рух фракціоніруемих молекул вниз по стовпчику. Рухливу фазу, природно, становлять молекули, що знаходяться поза гранул. Вони рухаються разом зі струмом елюента. Нерухому фазу - молекули, що знаходяться усередині гранул. Такий поділ мало місце і при гель-фільтрації. Там нерухомі у зазначеному сенсі молекули були такими в силу їх розчинення в нерухомій водному середовищі, заповнювала гранули. Звичайно, і в цьому середовищі вони здійснювали броунівський рух, але це не спонукає їх до виходу з колонки. З матеріалом самих гранул вони якщо і взаємодіяли, то чисто механічно - наштовхуючись на нитки полімеру, що утворює гранули.
У разі іонообмінної хроматографії, навпаки, нерухому фазу, в основному, становлять молекули певним чином пов'язані з матеріалом гранул («сорбовані» на ньому). Пористість останніх у цьому випадку вибирають так, щоб фракціоніруемие молекули могли б практично безперешкодно проникати в гранули, заповнюючи весь їхній внутрішній обсяг.
Сама назва іонообмінна хроматографія вказує на те, що зв'язок молекул з гранулами повинна бути іонна. Тобто визначатися кулоновскими силами притягання між іонами протилежних знаків, закріпленими на нитках гранул та існуючими на поверхні молекул. Слова «закріплені» і «існуючі» наводять на думку про раз і назавжди фіксованої ситуації. Між тим, гнучкість і ефективність методу іонообмінної хроматографії спирається саме на можливість керування цією ситуацією, а разом з нею і силою зв'язку молекул фракціоніруемого речовини з матрицею гранул - характером сорбції цих молекул.

Іоногені групи
Замість незмінних іонів на нитках матриці й на поверхнях макромолекул (наприклад білків) розташовуються «іоногені групи», які залежно від умов в навколишньому їх водному середовищі (рН, наявність солей) можуть проявляти себе або як відкриті, несучі електричний заряд іони, або бути нейтралізуватися за рахунок зближення з ними несучих протилежний заряд іонів, наприклад Na + або С1-, а іноді за рахунок дисоціації або приєднання протонів Н +.
На поверхні білків йоногенних групами закінчуються бічні гілки таких амінокислот, як лізин та аргінін або аспарагінова і глутамінова кислоти. Дисоціація протона в першому випадку і асоціація у другому нейтралізують ці групи. Обидва ці процесу залежать від концентрації протонів у навколишньому водному середовищі, тобто від величини рН (відповідно в лужному або кислому області). Замість хімічної модифікації, якою є обидва названі явища, нейтралізація заряду ионогенной групи може відбуватися і за рахунок його екранізації протилежно заряджених іоном, підходить під дією кулонівської сили впритул до ионогенной групі з навколишнього середовища. Ковалентного хімічного зв'язку не утворюється. Екрануючий іон в цьому випадку іменується «контріоном».
Іоногені групи, здатні виявляти свій позитивний заряд, іменуються «аніонітами» - вони в якійсь мірі подібні аноду в електричному ланцюзі. Групи, що відкривають свій негативний заряд, відповідно іменуються «катіоніту». Для модифікації ниток хроматографічних гранул практика відібрала невелике число йоногенних груп різної «сили». Найбільш вживаними для «аніонообмінником» (хроматографічних матриць, несучих аніоніти) є: діетіламі-ноетіл - скорочене позначення ДЕАЕ і ді-етил-2-оксіпропіламіноетіл скорочене позначення QAE. Зауважимо, що перша з цих груп порівняно легко може нейтралізуватися хімічно в лужному середовищі за рахунок втрати протона. Друга - несе позитивний заряд при будь-якому значенні рН середовища і може нейтралізуватися тільки екранізацією негативно зарядженим контріоном. Відповідно до цього відзнакою аніонообменнікі на основі ДЕАЕ іменуються «слабкими», а обмінники на основі QAE - «сильними».
Аналогічно і в разі негативних йоногенних груп, «катіонообменнік» бувають «слабкими» - вони несуть карбоксіметільние групи і «сильними», які модифіковані сульфопропільнимі групами. Скорочені позначення цих груп, відповідно, СМ і SP. Сильні катіонообменнік зберігають свій негативний заряд у всьому робочому біологічному діапазоні значень (Рнз-11) і можуть бути тільки заекраніровани позитивними контріонамі.
Що ж стосується матриць, несучих описані модифікації (у разі фракціонування біополімерів), то це вже знайомі нам гранули на основі полісахаридів: сефадекса, хімічно зшиті агарози і целюлози. У їхніх торгових найменуваннях присутні і назва матеріалу матриці і скороченого вказівки ионогенной групи. Наприклад: «ДЕАЕ-сефадекса», «QAE-целюлоза», «СМ-сефадекса», «SP-сефароза CL» і т. д. У кожному типі пропонується кілька обмінників, що розрізняються між собою розмірами гранул і пор.
Матриці для іонообмінної хроматографії при високому тиску (на основі силікагелю) я залишаю осторонь. Фірма Pharmacia для своєї системи швидкої хроматографії білків розробила на основі виключно однорідних за розмірами гранул два типи сильних іонообмінників: аніонообмінником під торговою назвою «Моно Ф» - активна група тріметіламінометіл і катіонообменік «Моно S» - активна група сульфометіл.
Тепер корисно буде уявити собі деякі просторові співвідношення. Будемо орієнтуватися на очищення і фракціонування білків, оскільки це - основна область використання іонообмінної хроматографії. Діаметри глобулярних білків (на відміну від їх мас) варіюють не дуже сильно. Так наприклад, молекула бичачого сироваткового альбуміну (М = 69 000) має в поперечнику 70 А, а молекула гамма-глобуліну (М = 150 000) близько 100 А. (Зважаючи на ці цифр я не згадував матриці на основі полістиролу, оскільки у них розмір пір лежить в межах 5-20 А.)
Пористість матриць, використовуваних для фракціонування білків, лежить в діапазоні 300-1000 А. У таких порах молекули білків можуть переміщатися настільки ж вільно, як тенісний м'ячик у виготовленій з дроту просторової сітці з ребром комірки в 30-40 см.
На поверхні білків можуть перебувати іоногені групи амінокислот обох знаків (усі - слабкі), віддалені один від одного на відстані у кілька десятків ангстремів. Іоногені групи всередині гранул могли б розташовуватися тісніше, оскільки приєднання по ОН-груп могло б здійснюватися у кожній ланці глюкози. Але це марно, тому що з двома настільки близько розташованими групами не змогли б у силу своїх розмірів взаємодіяти одночасно дві молекули білка, і невигідно, оскільки може мати наслідком дуже міцним зв'язуванням однієї молекули в декількох точках. Практика виробила для середньої відстані між йоногенних групами на одній матриці величину в 10-30 А.
Іони і контріони
Ще слід нагадати, що в рідині, що заповнює пори іонообмінника, обов'язково присутні контріони. По-перше, від самого іонообмінника, який надходить в розпорядження експериментатора завжди в нейтральній формі, тобто разом з контріонамі (Na +, K + або С1 - форми). По-друге, це контріони йоногенних груп білків і, нарешті, це іони, присутні в елюент з волі дослідника.
Контріони, завдяки електростатістіческому тяжінню, знаходяться поблизу відповідних іонів, але не пов'язані з ними хімічним зв'язком. Тому під впливом теплових ударів молекул води легкі контріони часто відходять від йоногенних груп на значні відстані, а іноді і зовсім відриваються від них (кулонівських сили з відстанню убувають дуже швидко). Але дуже скоро ці контріони або повертаються, або замінюються іншими, такими самими. Коли контріон знаходиться поблизу іона ионогенной групи, він нейтралізує (екранує) поле його заряду, коли видаляється - для електричного поля іона відкривається можливість взаємодіяти з іншими іонами, в тому числі з іонами, які відкрилися на поверхні опинилася поблизу молекули білка.
Якби оголення заряду на матриці супроводжувалося світінням, а самі ми, перетворившись на «супергномов», опинилися всередині гранули іонообмінника, то нашим очам представилася б чарівна картина мерехтіння незліченної безлічі розкиданих по всьому об'єму вогників. (Припустимо, що червоних, якщо заряди позитивні.) Чим вище концентрація солі в елюент, тим менше часу кожен із зарядів іонообмінника залишався б відкритим і, відповідно, менше число їх було б відкрито одночасно - червоні спалахи світла стали б коротшими і число вогників зменшилася . Якщо іонообмінник слабкий, то загальне число йоногенних груп матриці, що беруть участь в цьому «феєрверку», можна було б регулювати змінами рН елюента, нейтралізуючи хімічно частина йоногенних груп.
Тепер доповнимо нашу уявну картину повільно пливуть всередині гранули великими молекулами білка. На них теж спалахують вогники. Але вже двох кольорів: червоні і сині, так як крім позитивних аніонітів на поверхні білка є й негативні іоногені групи - катіон-ти. Зрозуміло для них теж знайдуться контріони. При змінах рН середовища буде збільшуватися інтенсивність світіння одних слабких йоногенних груп білка і одночасно зменшуватися інтенсивність світіння інших (іншого кольору). Іони солі, що знаходяться в елюент, впливають на електричну активність незаблокованих за рахунок рН йоногенних груп білка у відповідності зі своїми зарядами.
Хроматографічне фракціонування білків
Ми підготували матеріал для уявного розгляду процесів закріплення молекули білка на матриці іонообмінника і його звільнення від зв'язку з нею. Для початкової фіксації цієї молекули необхідне одночасне здійснення двох або, мабуть, навіть трьох умов. По-перше, білок повинен підійти до нитки полімеру так, щоб різнойменно заряджені іони на його поверхні і на нитки сорбенту виявилися зближеними до відстані, на якому ефективно діє кулонівська сила тяжіння. По-друге (і по-третє) обидва зблизився іона мають бути не заблоковані контріонамі. Хоча ймовірність такого збігу здається і невеликий, але число зіткнень з нитками іонообмінника, яке відчуває кожна молекула білка за одиницю часу настільки велике, що практично за кілька хвилин для кожної з молекул, що знаходяться всередині гранули, сприятлива ситуація реалізується хоча б один раз. Молекула в цей момент виявиться пов'язаної з матрицею. Її поступальний рух припиниться, хоча під тепловими ударами молекул води молекула білка буде повертатися близько єдиної точки своєї фіксації.
Відірвати макромолекулу білка від матриці буде нелегко, тому що велика маса зумовить інерційність її поведінки, а також тому, що різноспрямовані імпульси ударів об поверхню білка багатьох молекул води будуть врівноважувати один одного. Тим не менш, неминуче наступить момент, коли рівнодіюча цих імпульсів виявиться достатньо великий для того, щоб видалити молекулу білка на таку відстань, де кулонівське тяжіння помітно ослабне - молекула відірветься від матриці. Якщо концентрація відповідних контріонов в околицях обох іонів буде мала і обидва вони протягом деякого часу будуть «відкриті», то є шанс, що відійшла недалеко молекула білка за рахунок броунівського руху знову зблизиться з тим же самим іоном матриці так, що відновиться її початкова фіксація . Якщо ж концентрація контріонов досить велика і хоча б один з раніше взаимодействовавших іонів виявиться заблокованим, білок остаточно відірветься від даної точки матриці і відновить своє дифузійне рух до тих пір, поки збіг сприятливих умов не фіксує його в новій точці всередині гранули або поки він не покине її межі і вийде в навколишній елюент. Втім, в той же момент з елюента в гранулу в процесі дифузії, імовірно, увійде точно така ж молекула білка.
Легко собі уявити, що в перші ж хвилини після внесення суміші білків на колонку для кожного з них незалежно встановиться динамічна рівновага розподілу фіксованих і вільних молекул, що відповідає даним значенням рН елюенту і концентрації солі. А разом з ним і динамічна рівновага концентрацій цих молекул в рухомій і нерухомій фазах. (На відміну від гель-фільтрації, завдяки сорбції на обміннику рівновагу концентрацій буде сильно зрушено убік нерухомої фази.)
Після початку елюції вільно поточний елюент буде відносити молекули, що вийшли з гранул, вниз по стовпчику. У результаті чого динамічну рівновагу концентрацій у вищележачому шарі буде відновлюватися (на більш низькому загальному рівні) за рахунок виходу молекул з нерухомої фази в рухливу. А в ніжележащем спочатку «порожньому» шарі гранул динамічну рівновагу концентрацій у двох фазах буде створюватися за рахунок переходу молекул з елюента в гранули та їх сорбції там. З новими порціями вільного елюента, що надходить на колонку, цей процес буде тривати, переносячи все більше число молекул з вищого шару в ніжній ... Таким чином зона пов'язаного білка буде поступово (і дуже повільно) просуватися вниз по стовпчику. Це просування буде відбуватися з різною швидкістю в різних білків відповідно до їх індивідуальними особливостями. У першу чергу з кількістю і просторовим розташуванням йоногенних груп на поверхні білка. Так буде тривати аж до виходу рухалися зон з колонки у вигляді більш-менш вузьких «піків» колоколообразной форми. Виходити ці піки будуть, очевидно, в тому ж порядку і з такими ж інтервалами (або перекриттями!), З якими рухалися по колонці зони зв'язування відповідних білків. Це і є істинний процес хроматографічного фракціонування.
До цих пір ми ігнорували можливість знаходження на поверхні білка двох і більше йоногенних груп відповідного знака. Проте з наведених раніше цифр випливає, що відстані між двома такими групами на поверхні білкової глобули і між йоногенних групами на іонообмінника мають один і той самий порядок величини. Це означає можливість реалізації наступного ланцюга подій.
Молекула білка в результаті електростатичної зв'язку одного зі своїх зарядів з нерухомим іоном матриці закріплюється в одній точці і починає, як вже було сказано, повертатися щодо цієї точки. Може виявитися, що при одному з таких поворотів другий заряд на її поверхні виявиться поблизу заряду протилежного знаку на тій же чи іншій, близько проходить нитки обмінника. Виникає друга електростатична зв'язок молекули білка з матрицею. Така подія якісно змінює ситуацію. Закріплення білка на обміннику виявляється не вдвічі, а на порядок величини більш міцним. Це обумовлено незалежністю двох зв'язків, що дозволяє їм як би «страхувати» одне одного. Уявімо собі, що під тепловими ударами молекул води одна з зв'язків розірвалася. Утримувана другого зв'язком молекула білка не зможе далеко відійти від місця першого контакту. Вона буде повертатися близько цієї другої зв'язку, і дуже ймовірно, що в ході таких поворотів перший зв'язок відновиться. В іншій момент дві ці зв'язки можуть помінятися ролями.
Щоб вклинитися у це явище «взаємної страховки», тобто щоб блокувати відновлення першої розірваної зв'язку до того момецта, коли розірветься і друга зв'язок, буде потрібно значне збільшення концентрації контріонов солі в елюент. Якщо ж молекулі білка вдасться закріпитися в трьох точках, то зняти її виявиться дуже важко або навіть неможливо (відбудеться необоротна сорбція білка на іонообмінника).
У силу сказаного, для успішного фракціонування суміші білків слід до внесення препарату на колонку врівноважити рідку фазу обмінника розчином солі такої концентрації, яка гарантувала б освіту не більше, ніж двоточкових зв'язків для всіх білків суміші з матрицею.
Вибір умов хроматографії (наприклад, для фракціонування суміші білків)
Цей вибір, навіть для випадку, коли всі підлягають поділу білки відомі і, більш того, є в чистому вигляді, виявляється справою непростим, які вимагають чималого досвіду, розуміння фізичних процесів, що лежать в основі фракціонування і навіть певної інтуїції. Дуже ризиковано (з точки зору втрати цінного препарату) намагатися сліпо повторювати умови хроматографії, описані в науковій літературі навіть для точно такого ж або дуже схожого випадку. Реальні характеристики іонообмінника тієї ж марки (вони варіюють від партії до партії) або використовуються реактивів можуть виявитися іншими. Так само як і особливості вихідних препаратів. Прийнявши до уваги описану процедуру, дослідник повинен сам продумати і спланувати свій хроматографічний експеримент. Сюди увійдуть, як мінімум:
1. Вибір іонообмінника (його сили, розміру гранул, пористості).
2. Вибір геометрії колонки (довжина і діаметр).
3. Вибір рН буфера з позицій як найбільш вигідних умов фракціонування, так і збереження біологічної активності всіх білків суміші, наприклад ферментів.
4. Вибір концентрацій солі (контріонов) у елюент.
5. Вибір типу елюції: ізократіческой (з незмінною концентрацією солі), ступінчастою або градієнтної (і якої форми градієнта!)
6. Вибір швидкості елюції.
Всі ці умови треба підбирати одночасно, з урахуванням їх взаємозв'язку з метою оптимізації результатів фракціонування. Було б занадто громіздко викладати тут способи вибору кожного з названих параметрів хроматографічного процесу. Для ілюстрації зупинюся на пунктах 4 і 5 - виборі концентрації солі і способи маніпуляції цієї концентрацією.
Вище було показано, що просування хроматографічних зон зв'язування білків з колонці обумовлено, зокрема, їх десорбцією в місцях первинного і всіх наступних закріплень на матриці в гранулах. За рахунок десорбції відновлюється динамічну рівновагу концентрацій молекул в нерухомої і рухомої фазах шару гранул, порушене витіканням елюента, що оточував цей шар. Десорбція спочатку сор-бірованних молекул білка визначається концентрацією соляної в рідині всередині гранул. Якщо вона занадто мала, то десорбції практично не відбувається. Навпаки - відкриті іоногені групи матриці як би «висмоктують» з елюенту і закріплюють на себе молекули білка. Якщо ж концентрація солі в елюент (а значить і всередині гранул) занадто велика, то практично всі молекули білка десорбуються з матриці в рідке середовище, їх концентрації в нерухомої і рухомої фазах зрівнюються, як при гель-фільтрації.
Маючи це на увазі проведемо подумки наступний попередній досвід. Обраний іонообмінник, урівноважений вже обраним буфером розіллємо рівними порціями в 10 пробірок. Гранули обмінника, природно, сядуть на дно. Потім серією «декантації« (тобто зливом надосадової рідини, заміною її на той самий буфер, але з певною концентрацією солі, струшуванням, осадженням - і так кілька разів) добиваємося того, щоб концентрація солі всередині гранул поступово збільшувалася від першої пробірки до десятою в певних межах (їх доведеться підібрати для кожного білка). Потім в усі пробірки внесемо однакову кількість концентрованого водного розчину одного з білків, що входять до складу підлягає фракціонування суміші. Струшуємо пробірки, даємо відстоятися осаду і по ультрафіолетовому поглинання (або ферментативної активності) оцінюємо концентрацію білка в кожному з десяти супернатант.
Знаходимо першу пробірку, в супернатанті якої наш білок тільки-но з'являється. Тим самим визначаємо концентрацію солі, при якій динамічному рівноваги відповідає мінімальна десорбція білка з матриці. У наступних пробірках у міру збільшення концентрації солі, білка буде ставати все більше - десорбція при встановленні дінамл-чеського рівноваги буде все значніше. Нарешті, прийдемо до такої ситуації, коли концентрація білка в супернатанті виявиться максимальною і при подальшому збільшенні концентрації солі зростати вже не буде. Концентрація солі в першій з цих пробірок вкаже момент повної десорбції білка з матрзіци. У відсотках від цієї концентрації оцінимо і ступінь десорбції в проміжних точках нашого аналізу і побудуємо залежність відсотка десорбції даного білка від концентрації солі в умовах динамічної рівноваги. Те ж саме проробимо для всіх інших білків майбутньої суміші і отримаємо серію кривих такого типу, як показано на рис.

Рис.
Розглядаючи цю серію кривих, можна зробити висновок, що при ізократіческой елюції буфером з незмінною сольовий концентрацією, наприклад, відповідній точці Ар можна сподіватися розділити білки 1-4. Білок 1 буде відразу ж повністю десорбіpoвать і вийде в першу чергу - з струмом елюента. За ним підуть в порядку зростання міцності сорбції білки 2, 3 і 4. Зона зв'язування кожного наступного із них буде рухатися по колонці повільніше, ніж зона попереднього білка. Білок 5 в цих умовах зовсім не вийде з зони початкового нанесення препарату на колонку. Його можна зняти окремо, збільшивши концентрацію солі в елюент до значення Ag. Це вже буде «двоступенева» елюція.
Якщо виявиться, що при концентрації Аg білки 3 і 4 поділяються погано, можна скористатися триступеневої елюції, вибираючи концентрації солі в точках Вр Bg і Bg. Тоді спочатку вийдуть добре розділились білки, 1 і 2, потім також непогано розділені білки 3 і 4 і, нарешті, білок 5.

Література:
1 Курашвілі Л.В., Бобильова Л.М. Визначення тригліцеридів у фракції ліпопротеїдів високої щільності / Лабораторне справу. - N 7. - 1991. - С.7576.
2 Курашвілі Л.В., Владимирова А.А. Вміст тригліцеридів у ліпопротеїнів високої щільності у хворих на ішемічну хворобу серця / / Кардіологія. - 7-8. - 1992. - С.35-38.
3 Курашвілі Л.В., Волков А.С. Прогностична значущість визначення холестерину у фракції ліпопротеїдів високої щільності у донорів крові / / Гематологія і трансфузіологія. - N 5. - 1993. - С.39-41.
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Реферат
41.7кб. | скачати


Схожі роботи:
Іонообмінна хроматографія 2
Хроматографія
Лігандообменная хроматографія
Адсорбційна хроматографія
Ексклюзійна хроматографія
Газова хроматографія
Іонно-парна хроматографія
Іонно парна хроматографія
Іонна хроматографія Добавка електроліту
© Усі права захищені
написати до нас
Рейтинг@Mail.ru